一株去除亞硝態氮細菌分離鑒定及特性研究

姚艷玲，袁春營，崔青曼，呂 軍

( 1.松遼水環境科學研究所，吉林 長春 130021； 2.天津科技大學 海洋與環境學院，天津 300457 )

近年來，隨著凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)集約化養殖的迅猛發展，水環境惡化和種質退化導致病害頻發[1]，給養殖戶造成巨大的經濟損失，嚴重影響了對蝦養殖業的健康穩定發展。益生菌是一類對宿主有益的活性微生物，是定殖于宿主腸道內，能產生確切健康功效從而改善宿主微生態平衡、發揮有益作用的活性有益微生物的總稱。在凡納濱對蝦養殖水體中投入微生態制劑，可明顯增強對蝦血清的酚氧化酶、超氧化物歧化酶、堿性磷酸酶活性及抗菌活力和溶菌活力[2-4]。然而，目前用于對蝦水質調控的微生態制劑以光合細菌、芽孢桿菌(Bacillus)、酵母菌和乳酸菌等為主[5]，針對水體亞硝態氮去除的微生物鮮有報道。

水產養殖動物的殘余餌料、排泄物、死亡尸體等大量有機物在微生物的作用下，產生大量氨氮等含氮有害物質，氨氮在亞硝化細菌和光合細菌作用下轉化成亞硝態氮，亞硝態氮進一步與胺類物質結合，形成具有強致癌作用的亞硝胺[6]。通常情況下，利用亞硝態氮的硝酸細菌為自養細菌，生長緩慢，造成亞硝態氮的快速積累，亞硝態氮的長期蓄積會直接導致魚、蝦等養殖對象抗病力的降低，引起各種病原菌的繼發性侵襲，通常被視作是魚、蝦的致病根源[7]。因此，分離篩選去除亞硝態氮的異養硝酸細菌，并應用于水產養殖，對于快速降低養殖水體中的亞硝態氮，確保養殖動物健康生長，具有重要的實踐意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株

試驗菌株自天津漢沽養蝦后期池水中分離純化得到。

1.1.2 培養基

C4H6O43 g/L，NaNO20.32 g/L， Na2HPO4·12H2O 0.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，微量元素(EDTA 0.5 g/L，ZnSO4·7H2O 0.22 g/L，CaCl20.055 g/L，MnCl2·4H2O 0.051 g/L，FeSO4·7H2O 0.049 g/L，CuSO4·5H2O 0.0157 g/L，CoCl2·6H2O 0.016 g/L) 5 mL/L，pH 7.5。該培養基用于篩選和脫氮試驗。

1.1.3 主要儀器

S.SW-CJ-1CU超凈工作臺(上海躍進醫療器械廠)，TGL-16高速冷凍離心機(湖南長沙湘儀離心機儀器有限公司)，QYC-2102C立式雙層小容量恒溫培養振蕩器(上海新苗醫療器械制造有限公司)，T1810紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)，T100 PCR擴增儀(美國Bio-Rad公司)，ChemiDoc XRS型凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)，HT7700透射電子顯微鏡(日本日立公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的分離與篩選

500 mL錐形瓶中加入200 mL培養基，接入10 mL養殖水體，置于30 ℃恒溫搖床中培養3 d。取富集培養的樣品1 mL，用稀釋梯度法依次稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度，從樣品10-3梯度開始分別取0.1 mL 菌液，涂布于培養基平板上，生化培養箱30 ℃培養，24 h 后，挑取單個菌落，于相應的培養基平板上純化培養。將純化后的所有菌株分別接種于異養培養基中，170 r/min、30 ℃條件下培養，定期檢測亞硝態氮含量(亞硝態氮測定采用重氮—偶氮法[8])，選擇亞硝態氮去除效果最好的一株作為目的菌株，編號為LQ1。

1.2.2 菌株的鑒定

1.2.2.1 菌株的亞顯微觀察

菌株LQ1經過脫水、干燥、鍍膜后用掃描電子顯微鏡觀察。

1.2.2.2 菌株的部分生理生化特征

對分離篩選到的菌株按照《常見細菌系統鑒定手冊》[9]方法進行葡萄糖、乳糖發酵，硝酸鹽還原試驗，甲基紅試驗，明膠液化試驗，吲哚試驗。

1.2.2.3 菌株的16S rDNA同源序列分析

按照Invitrogen 試劑盒說明書提取細菌DNA，細菌通用引物8F和1492R進行PCR擴增。引物上游8F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3′；下游1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR體系為50 μL，其中包括：5 μL 10×buffer，4 μL dNTPs，正反引物各1 μL，Taq 酶1 μL，DNA 模板1 μL，37 μL 無菌去離子水。擴增程序：94 ℃，預變性5 min;94 ℃，變性30 s，60 ℃，退火30 s，72 ℃延伸 2 min，進行30 個循環;最后72 ℃ 10 min。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，16S rDNA產物委托北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序，利用BLAST軟件，將測序結果與美國國立生物技術信息中心(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)中有關序列進行同源性分析。

1.2.3 最佳脫氮條件的篩選

1.2.3.1 碳氮比對菌株去除亞硝態氮的影響

改變培養基中NaNO2的含量，使其碳氮比分別為7、10、13、16、19、22、25，接入5%的菌株LQ1， 30 ℃，130 r/min的搖床中培養，6 h和12 h測定亞硝態氮含量。

1.2.3.2 初始pH值對菌株去除亞硝態氮的影響

分別將培養基的pH調至3、5、7、9、11，其他方法同1.2.3.1。

1.2.3.3 溫度對菌株去除亞硝態氮的影響

培養基溫度設置20、25、30、35、40、45 ℃ 6個梯度，其他方法同1.2.3.1。

1.2.3.4 脫氮率的計算

ρB/%=(ρ1-ρ2)/ρ2×100%

式中，ρB為脫氮率，ρ1初始亞硝態氮質量濃度；ρ2一定時間后亞硝態氮質量濃度。

1.3 數據處理與分析

所有試驗數據均采用單因素方差分析。分析軟件為SPSS 17.0，試驗數據均以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離純化

以亞硝態氮為唯一氮源的培養基，共篩選到6株去除亞硝態氮菌株，其中菌株LQ1去除效果最好。

2.2 菌株LQ1的形態與生理生化特征

2.2.1 菌株LQ1的形態

菌株LQ1在培養基平板上培養1 d，觀察到菌落較小，灰白色，周邊光滑圓潤，表面規則；革蘭氏染色陰性，細胞呈桿狀，有鞭毛，大小為(2～3) μm×(0.5～1) μm(圖1)。

2.2.2 生理生化特征

菌株LQ1的生理生化特征見表1，該菌株可以發酵葡萄糖和乳糖，還原硝酸鹽，不能液化明膠，不產生吲哚，甲基紅試驗陰性。

圖1 菌株LQ1的亞顯微形態

鑒定指標葡萄糖發酵乳糖發酵硝酸鹽還原甲基紅試驗明膠液化吲哚試驗鑒定結果+++---

2.3 菌株LQ1的16S rDNA序列分析

菌株LQ1經PCR擴增，擴增產物的瓊脂糖電泳結果見圖2，16S rDNA 測序，所測菌株的序列通過Blast檢索，并與GenBank中的核酸序列進行同源性比對，利用MEGA 軟件，以鄰接法繪制16S rDNA系統發育樹(圖3)，經16S rDNA 的同源性比較，菌株LQ1與脫氮海洋單胞菌(Oceanimonasdenitrificans)的相似性達99%。結合菌株LQ1的菌落形態、亞顯微形態和生理生化特征，確定分離到的菌株LQ1為脫氮海洋單胞菌。

2.4 脫氮海洋單胞菌生長曲線的制作

在溫度35 ℃、pH 9.0、碳氮比為22、氯化鈉質量濃度15 g/L條件下，將脫氮海洋單胞菌LQ1培養24 h，繪制細菌生長曲線，結果見圖4。由圖4可見，1～3 h期間，細菌為遲緩期，4～21 h為對數生長期，21 h以后為穩定期和衰退期。

2.5 脫氮海洋單胞菌去除亞硝態氮效果

將脫氮海洋單胞菌LQ1接種到培養基中，定期檢測亞硝態氮含量的變化，結果見圖5。由圖5可見，隨著時間的延長，培養體系中亞硝態氮質量濃度逐漸減小，12 h時，亞硝態氮質量濃度達到0.73 mg/L，去除率達98.69%，可見脫氧海洋單胞菌LQ1具有很好的亞硝態氮去除效果。

圖2 菌株LQ1的16S rDNA電泳圖譜

圖3 基于16S rDNA 序列同源性的菌株LQ1 的系統發育樹

圖4 脫氮海洋單胞菌LQ1生長曲線

圖5 脫氮海洋單胞菌LQ1去除亞硝態氮效果

2.6 碳氮比、pH和溫度對脫氮海洋單胞菌LQ1脫氮率的影響

2.6.1 碳氮比對脫氮率的影響

設置7個碳氮比梯度，研究其對菌株脫氮率的影響，結果見圖6。由圖6可見，試驗6 h和12 h出現了類似的結果，均是碳氮比為7時，脫氮率最低，而后逐漸增加；當碳氮比達到16時，脫氮率達到最大，為99.22%，而后隨著碳氮比的增加，脫氮率略微降低，但幅度很小，說明碳氮比為16時，脫氮海洋單胞菌LQ1的脫氮效果最好。

圖6 碳氮比對脫氮海洋單胞菌LQ1脫氮率的影響

2.6.2 pH值對脫氮率的影響

將脫氮海洋單胞菌LQ1接入到不同初始pH值的培養基中，其脫氮率結果見圖7。由圖7可見，隨著pH的增加，菌株的脫氮率逐漸增大，pH為9時，脫氮率最大，12 h脫氮率達98.73%，而后隨著pH的增加，脫氮率逐漸減小。可見脫氮海洋單胞菌LQ1脫氮適宜的初始pH為9。

圖7 pH對脫氮海洋單胞菌LQ1脫氮率的影響

2.6.3 溫度對菌株脫氮率的影響

將脫氮海洋單胞菌LQ1接入培養基，置于不同溫度下培養，分別于6 h和12 h測定亞硝態氮含量，并計算脫氮率，結果見圖8。由圖8 可見，隨著溫度的升高，菌株的脫氮率逐漸增大，當溫度增至35 ℃時，菌株的脫氮率最大，達98.06%，而后隨著溫度的升高，菌株的脫氮率出現降低的趨勢，但減幅緩慢，說明脫氮海洋單胞菌LQ1的脫氮適宜在較高溫度下進行。

圖8 溫度對脫氮海洋單胞菌LQ1脫氮率的影響

3 討 論

傳統意義上的硝化作用指自養硝化。雖然自養硝化菌在水體氮循環中起到非常重要的作用[10]，但自養硝化細菌分離困難、生長速度慢、生物量小、代時長及對環境因子敏感等特點[11]在一定程度上阻礙了硝化細菌在水產養殖領域的推廣應用。異養硝化細菌以其生長速度快、代時短及對環境因子遲鈍等特點，引起了人們的極大關注。研究者分離鑒定出來了一些異養硝化細菌[12-16]，但自水產養殖水體中分離鑒定異養硝化細菌還較少見，研究異養硝化細菌的脫氮機理也不多。芮傳芳等[17]從巢湖底泥中分離出一株具有氨氮轉化活性的異養硝化細菌，鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)；王李寶等[18]自江蘇通州、海安和呂四地區的養殖池塘淺層底泥中分離得到4株具明顯硝化活性的異養硝化細菌，通過形態學和生理生化研究，初步鑒定為芽孢桿菌。崔青曼等[19]從對蝦底泥中分離純化出一株高效去除亞硝態氮的細菌，鑒定為鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)；袁春營等[20]進行了魯氏不動桿菌(A.lwoffii)的鹽度馴化與亞硝態氮去除機理研究。鄭宗林等[21]從福州市閩侯縣高岐工業園區某工廠排污口淤泥及垃圾滲出液中分離出一株反硝化聚磷菌和一株高效聚磷菌，經生理生化特征分析并結合16S rRNA編碼基因序列分析對兩株菌進行鑒定，二者分別為類產堿假單胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)和瓊氏不動桿菌(A.junii)。本次從對蝦養殖后期水體中分離一株硝化細菌，具有良好的亞硝酸氮去除效果，并確定了它的最佳脫氮條件，下一步擬進行脫氮海洋單胞菌LQ1的脫氮機理研究，同時與其他微生物配伍，制備對蝦專用微生態制劑，以期降低對蝦養殖后期水體中的亞硝態氮含量，確保對蝦健康生長。