雜交黃顙魚(黃顙魚♀×瓦氏黃顙魚♂)及其雙親遺傳多樣性的微衛星分析

張佳佳，李 杰，張國松，2，王 濤，尹紹武，唐忠林，茆健強，王若然

( 1.南京師范大學 生命科學學院，江蘇省生物多樣性與生物技術重點實驗室，江蘇 南京 210023； 2.菏澤學院，生命科學系，山東 菏澤274000； 3.南京市水產科學研究所，江蘇 南京 210036 )

瓦氏黃顙魚(Pelteobagrusvachelli)與黃顙魚(P.fulvidraco)均屬鲇形目、鲿科、黃顙魚屬，是黃顙魚屬中經濟價值較高的兩個種類[1-2]。由于這兩種魚具有肉嫩味美、高營養、無肌間刺等特點，深受廣大消費者的喜愛[3]。瓦氏黃顙魚主要在江、河等流水水體(如與長江支流相通的大水面湖泊、河流水體)中活動，是黃顙魚屬中個體最大的種類，據報道最大個體質量可達1850 g。與黃顙魚相比，瓦氏黃顙魚生長速度較快，當年苗種即達上市規格[1]，其缺點是對水體溶解氧含量的要求較高，如水體內溶解氧水平過低(<2 mg/L)，即產生浮頭現象，在高密度池塘養殖中，溫度超過32 ℃時泛塘死亡率大大上升[4]。黃顙魚在我國各大水系均有分布，相比瓦氏黃顙魚有較高的耐低氧能力，適合于池塘養殖，但存在個體小、生長速率較慢的缺點，在高密度的池塘養殖中，當年苗種較難達上市規格(80 g以上)[1]。已報道的黃顙魚雌魚與瓦氏黃顙魚雄魚雜交子代體型厚實，與雙親相比具有明顯的生長優勢，餌料系數低，具有一定的抗病能力，近年來已成為水產養殖較受歡迎的品種之一[5]。目前關于雜交黃顙魚的研究主要集中在繁殖育種、養殖技術、形態、生長和肌肉營養價值分析等方面[6-10]。如李镕等[8]采用主成分和聚類分析的方法對黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交子代的形態進行分析，結果顯示，雜交黃顙魚與黃顙魚的親緣關系更近，且體色接近黃顙魚；王峰[9]對雜交黃顙魚及其雙親的生長速度和肥滿度等進行比較，結果表明，雜交黃顙魚的絕對質量增加率分別比親本黃顙魚、瓦氏黃顙魚高0.0097、0.0459 mm/d；張佳佳等[10]對雜交黃顙魚的肌肉營養成分進行分析，結果表明，雜交黃顙魚屬優質營養資源，且雜交黃顙魚的粗蛋白含量高于雙親黃顙魚和瓦氏黃顙魚。已有的研究結果表明，雜交黃顙魚具有一定雜種優勢，有很好的選育潛力和市場前景，因此分析雜交黃顙魚的遺傳背景非常必要，但關于雜交黃顙魚遺傳分析鮮有報道。

微衛星DNA又稱為短串聯重復序列或簡單重復序列[11]，是一種在真核生物基因組中廣泛分布的DNA片段。作為近年來發展迅速、應用廣泛的分子標記之一，微衛星DNA具有種類多、分布廣、符合孟德爾共顯性方式遺傳、多態信息含量高、操作較為簡單等優點，是種群結構分析、個體識別、遺傳圖譜構建、種群評估、遺傳多樣性鑒定等研究的理想分子標記[12]，現已在珊瑚魚(Lutjanuscarponotatus)[13]、許氏平鲉(Sebastesschlegeli)[14]、星斑川鰈(Platichthysstellatus)[15]、鯉魚(Cyprinuscarpio)[16]等魚類中得到廣泛應用[17-18]。國內外關于黃顙魚屬的微衛星相關研究主要集中在黃顙魚微衛星標記的開發[19-21]，運用微衛星標記分析不同地理群體黃顙魚的遺傳結構及親緣關系[22-23]等方面。未見運用微衛星標記進行雜交黃顙魚及其親本遺傳多樣性及遺傳背景分析的相關報道。因此，本研究利用9對多態性較高的微衛星引物對黃顙魚、瓦氏黃顙魚及雜交子代進行遺傳多樣性比較分析，為黃顙魚屬這3種魚類群體遺傳評估和雜交黃顙魚新品種選育提供理論依據和基礎資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料瓦氏黃顙魚、黃顙魚和雜交黃顙魚(黃顙魚♀×瓦氏黃顙魚♂)取自南京市水產科學研究所，3種魚群體均為2016年6月通過人工繁殖獲得，親本均采自長江中下游地區。其中黃顙魚體質量(12.45±3.12) g；雜交黃顙魚體質量(18.45±5.01) g；瓦氏黃顙魚體質量(16.35±3.73) g，3種魚均健康無疾病，分別選取32尾，剪取適量尾鰭，保存于加入無水酒精的1.5 mL無菌離心管中。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取

使用上海捷瑞生物公司的細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)對瓦氏黃顙魚、黃顙魚、雜交黃顙魚尾鰭DNA進行提取，并使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性與純度，-20 ℃保存備用。

1.2.2 微衛星引物

首先從瓦氏黃顙魚轉錄組EST序列篩選獲得53個微衛星多態性位點，在這些位點所設計的引物中有42對能夠在黃顙魚和雜交黃顙魚中穩定擴增(表1)，挑選等位基因數較多、多態性好的9對引物用于黃顙魚、瓦氏黃顙魚和雜交黃顙魚3個群體的遺傳分析，引物信息見表2，引物由生工生物工程公司合成。

表1 瓦氏黃顙魚53個微衛星位點的特征及各個遺傳參數

續表1

位點引物序列(5'→3')重復堿基Tm℃大小bpNaHoHePICPHWE擴增結果登錄號P36F:CAACGACTGGAGGTCAAACAR:AGCTGACGGAACTGTTACTGC(GT)855285～315120.6250.7900.7610.001**-KP735121P37F:TGAAATAGCTTGCCGTTGTGR:TGGATTGTTGTGAGGTTGGA(AC)853251～25740.5000.5630.4570.607+KP735122P39F:GGGATTAGGGTGTAGGGAGCR:CCCTAAGTTGAGCGCCTTTA(AC)858258～26850.7500.6550.6010.658+KP735123P40F:TCACTACCGGGGACTGACTTR:TAAAAATTCACCGGCCATTC(GT)853258～26020.1250.2220.1950.051+KP735124P43F:AGCATTGGAGCCGATCATACR:AGGCACCCTCAGTAAGAGCA(TG)859275～28130.3440.3040.2791.000+KP735125P44F:AGCAGCCTCTTCAACCGTTAR:CAGGTAGAGTGGGAGTGATGG(TG)858257～26130.1880.2940.2560.027*+KP735126P45F:TCAAACTGGGCAAAAACTCCR:AACGAAGGGGGTTTTCAGAT(AC)853249～279130.8130.8640.8340.004**+KP735127P49F:TTTTCTGAAGGAGACGTCGGR:CCAGGCAGGATGGTTACCT(AC)859272～27840.5630.5860.5370.042*-KP735128P50F:CTTCCCAGAAGTCTGAACGGR:TCCAGGATCAGGACATCACA(AAG)859268～28970.9380.7480.6980.649-KP735129P65F:CCACTGGCAAAACATTGAAAR:TCAGACCCGCCTTAATATGC(TCA)753231～23730.1250.1210.1161.000-KP735130P71F:ATGATCAAACACAGTGGGCAR:AGAAGACGGGAGGAGGAGAG(CAT)758254～26030.1250.3540.2980.000**+KP735131P84F:TGCTTCCTCTCCGCTATTGTR:GCAGCCACTATTATGAGCCC(TCC)656230～23320.4060.4840.3630.462+KP735132P86F:CTGGGAAACATCCTGGAAAAR:AACCATCCTGCAGGTGAGAC(TTG)659228～24360.9380.7900.7400.157-KP735133P88F:CACATGATCGTCACCTCGTCR:TGAGGATGATTCTGCACCTG(ATG)659218～22020.7810.4840.3630.000**+KP735134P90F:TTCCCTAAATGACCTCGTGCR:ACTTTCCCCCTTTACATCCG(GTT)653259～26830.5940.5490.4370.695+KP735135P92F:CGTTCACCGTTTTTCAGAGAR:AGATGCAGCGGTGCTTTAGT(ATG)658222～24070.9380.8010.7620.302+KP735136P93F:TCACCTGCCGATTTCTATCCR:TGCAAATGAACAGAAGCAATG(AAT)653249～25530.6560.6310.5440.345+KP735137P97F:GAACTGTACGGCACACTGGAR:TTTGATCGTTGCTTTCTTTGTC(TTA)556250～25320.1250.1190.1101.000+KP735138P98F:GCTTTGTCGTGATTTGAGCAR:CTCATGTGGAATGAACGCAC(TCT)559268～28970.8440.7280.6770.765-KP735139P102F:GGGCATGCTGAGGAACTAAAR:GGTTTAAACACCTGTTCCATCA(ATT)559232～24450.4690.7850.7370.002**-KP735140

續表1

位點引物序列(5'→3')重復堿基Tm℃大小bpNaHoHePICPHWE擴增結果登錄號P103F:GGAGCTGCCTGTCTATCTCGR:TGGACTGAAAAACTACAGGAAAA(GGT)558262～27450.5940.6670.6060.604+KP735141P111F:AGAAGTGCTGCACACCAATGR:TCCTGCCACTTGTCTAAGGAA(ATGT)558248～26450.3750.3540.3280.785+KP735142P114F:AGCGTGCTGGAGTATTGCTTR:CGGTTCAGAGGTTCACTCGT(AAAT)558281～28930.2810.4660.4110.016*+KP735143P117F:AGTCACAGACGCAGAAGCCTR:TAGCCGGAGTTACCAAATGC(TAGC)558249～26960.5310.6050.5250.133+KP735144P120F:AAACGCCAAAGAACCTGATGR:CTGACAAGACTGCAGCAAGC(TCCA)558231～24740.6250.5800.4780.506+KP735145P122F:GGCTGGTAAAATGGTGGTGTR:GAACAGTGCATGCAGGCTAA(AT)8aaa(GT)753282～28840.7500.6140.5220.008**+KP735146P123F:GGCTAGCGGCTCAATTACTGR:CTCCTGGGACATACACACCC(CA)7cgttttccttttttatgatacagtacggccacagcagggtga(GT)658254～28080.8440.7690.7230.419+KP735147P128F:TAATGAGCGGAACAGGGAAGR:ACACACAACTCACACCACCC(TG)7tacagggttgtgtgttggtgtgtgtacagggtggggtgtgctatgattgttgtgtgtgtactggatggtgtgagt(TG)658226～24450.5630.6100.5550.356+KP735148P136F:CAGACAGGAGGTGTGTGTGGR:GCAGCTGTCAGTCATGTGGT(G)11cagatgtgggcaagaattcatcctccctcagc(TG)8ttggactcgcct(TG)658273～29360.7190.6860.6210.009**+KP735149P139F:CGCTGAACTACACACACGGTR:ATCAGAGCCCATGCTGAGTT(AC)7aaaaaaaa(AT)658288～29440.5310.6590.5880.003**+KP735150P140F:TATGTGGTGGCCATGTCTGTR:TCAGACGGGAATTTGTCCTC(TG)6cgcacgcgcaagtgtgcaacccctatgtgaatgtccactgtgttgcagattttaagc(TG)758251～25530.5310.4930.4260.537+KP735151P141F:TGCTAGCAATTAGCACTGGGR:GGCATCAGGGTTTCTGGTTA(AC)7agacaaacacacacacat(AC)658279～28330.4380.4050.3540.231+KP735152P147F:GCGAGAGAGCCGTTATTTTGR:ATCTCTTTTGGCCTTTGCAC(TG)7cattttcttttttctgtatggaaattgttactgttttatgtgtgtgtaaatcctgtatttaaatc(CA)853232～24050.5000.6600.6020.006**+KP735153

續表1

位點引物序列(5'→3')重復堿基Tm℃大小bpNaHoHePICPHWE擴增結果登錄號P148F:TGCACTTGAAGATCAGTTGTGTTR:TCGATAATTCATGATTGCCA(GAT)5gtaatttaaatgtgtttctttaaaaattcttgagtcaagcctaaaactaaggtacaataaatac(TG)7cgcgtccgtgtgtatgtgtgtattatagaatta(AT)853279～29650.4060.3570.3341.000+KP735154P153F:GGGAGAGAAGAAGGGAATGGR:CGAAAGACAAAATGGAGGGA(TC)7catcgctccaagtgcttcctcccca(TTG)553279～28230.2190.3500.3180.019*+KP735155P155F:AAACGTACCCACAGAGCCACR:TCCAAAAATGGTGTCGTTCA(GT)9cctcaggttagaagtacttcaac(CA)658291～30850.4690.6280.5470.008**+KP735156P156F:TCAATACACTCGCTGACCCAR:AGCGTCCGAACAGAACAATC(TG)6ttgtgtattagataataaagcaaaaataataaggatccagaaaagtgtgggggtttaaatagaaataagg(ATA)558289～29430.4690.4580.3621.000+KP735157P165F:TCCTGGTACACTTTCGCACAR:TGGATGGCGATCATACTGAA(TGT)5tttgtttgtttttagct(CAG)558274～28030.6250.6280.5410.961+KP735158P169F:CACTTGCACTTCTCGTGTGAR:TAAACAGCCTCACCAAACCC(GAA)5aaaaa(AT)658290～29340.6560.7410.6790.069+KP735159P173F:TAGTGTTCCTGTGAAGCCCCR:AGGGAGAGCGTTTGTGCTAA(AGC)5atcctcacagtgctgatgcgttcagtgtgcgactggtcctgagcggcagcagcattacgatcctaacgtgataaactgagcaccgtctggtctggg(GT)958272～29780.6560.8210.7840.000**+KP735160P175F:TCTCCGGCGTTGTAGAAGTTR:TGGGAATCCTCGTGATTCAT(GA)7atcacgtgagggttctgtcagctgcgcttcactcctagctcaggggcagctgtgttacgtaaacaagtcggagatgaatgatttgtgttt(AC)858268～27140.8130.6480.5690.003**-KP735161

續表1

位點引物序列(5'→3')重復堿基Tm℃大小bpNaHoHePICPHWE擴增結果登錄號P177F:TGTCTGCGTGTGTACCTGTGR:ACGGCTCTGCTTCAGTCTGT(GT)8aagtttgtatgtccatgtgtcagtgtgtttgtccagctattcctatgtc(TG)658275～28540.6250.5520.4790.195+KP735162P184F:GTGAATTGGGTGAGTGGCTTR:GCCAAGTGGTGAAGGGATTA(GT)6(TG)658218～22230.5630.5000.4390.348+KP735163

注：Tm，退火溫度；Na，等位基因數；Ho，觀測雜合度；He，期望雜合度；PIC，多態信息含量；PHWE，哈德—溫格平衡χ2檢驗；*，差異性顯著(P<0.05)；**，差異性極顯著(P<0.01)；擴增結果，即該位點在普通黃顙魚和雜交黃顙魚中的擴增情況，“+”均有有效擴增，“-”非均有有效擴增.

表2 試驗所采用的9對微衛星引物的特征

1.2.3 PCR擴增及檢測

PCR反應體系為10 μL：2.85 μL 2×Taq Mix，0.04 μL 10 μmol/L M13-taile正向引物，0.16 μL 10 μmol/L反向引物，0.16 μL 10 μmol/L熒光基團，1 μL 50 ng/μL模板DNA，5.79 μLddH2O。PCR擴增的反應程序：95 ℃預變性5 min；32個循環，每個循環包括94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，將檢測到有單一條帶的產物上樣于ABI3500xl分析儀進行毛細管電泳，檢測產物片段大小。

1.3 數據分析

利用軟件GeneMarker 1.97分析微衛星位點的片段長度。利用POPGENE 1.32分析微衛星位點的等位基因數、有效等位基因數、觀測雜合度、期望雜合度、Nei氏遺傳距離以及遺傳相似度。利用PIC_CALC計算多態信息含量值。根據群體間的Nei氏遺傳距離，用Mega 5.0軟件非加權組平均法構建群體間聚類圖。

2 結果與分析

2.1 有效等位基因數、基因雜合度、多態信息含量

對9個擴增位點在黃顙魚、瓦氏黃顙魚和雜交黃顙魚3個群體中分別進行統計分析(表3)。黃顙魚群體的有效等位基因數為1.0317～3.4257，平均為2.5300；瓦氏黃顙魚群體的有效等位基因數為2.4704～5.2245，平均為3.7697；雜交黃顙魚群體的有效等位基因數為1.47937～5.2920，平均為3.0640。黃顙魚群體的觀測雜合度為0.0312～0.7931，平均為0.2970；瓦氏黃顙魚群體的觀測雜合度為0.5312～0.9375，平均為0.7292；雜交黃顙魚群體的觀測雜合度為0.1000～0.9667，平均為0.4492。黃顙魚群體的多態信息含量為0.0302～0.8688，平均為0.3803；瓦氏黃顙魚的多態信息含量為0.5250～0.7836，平均為0.6746；雜交黃顙魚的多態信息含量為0.2986～0.7871，平均為0.5696。

表3 黃顙魚、瓦氏黃顙魚和雜交黃顙魚的遺傳多樣性信息

2.2 遺傳距離及聚類分析

對黃顙魚、瓦氏黃顙魚和雜交黃顙魚的遺傳距離和遺傳相似度進行分析，由表4可見，黃顙魚和雜交黃顙魚的遺傳相似率(0.4063)高于瓦氏黃顙魚和雜交黃顙魚遺傳相似率(0.1621)，而黃顙魚和瓦氏黃顙魚的遺傳相似率最低(0.0116)。雜交黃顙魚和瓦氏黃顙魚的遺傳距離(1.8195)高于雜交黃顙魚和黃顙魚的遺傳距離(0.9006)，低于黃顙魚和瓦氏黃顙魚的遺傳距離(4.4568)。根據遺傳距離，用Mega 5.0軟件構建系統進化樹，雜交黃顙魚和黃顙魚先聚為一支，而瓦氏黃顙魚屬于最外支(圖1)?？梢婋s交黃顙魚和母本黃顙魚的親緣關系較近。

表4 黃顙魚、瓦氏黃顙魚和雜交黃顙魚的 無偏遺傳距離與遺傳相似度

注：對角線以上為遺傳相似度，對角線以下為遺傳距離。

圖1 黃顙魚、瓦氏黃顙魚和雜交黃顙魚的聚類分析

3 討 論

目前，國內外關于黃顙魚的育種工作主要集中在選擇育種和雜交育種兩個方面，通過遠緣雜交可以有效地增加群體遺傳結構變異和遺傳分化，提高群體的遺傳多樣性，因此雜交育種已經成為改善魚種品質的重要手段之一[28]。微衛星分子標記作為第二代分子標記技術，具有數量多、分布廣泛、易于檢測等優點，已經廣泛應用于物種多樣性檢測、分子輔助育種等方面[29]。群體的遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，是物種適應復雜環境、維持生存和進化的基礎[30]，其主要表現在等位基因數的豐富和均勻程度、遺傳雜合度的大小和多態信息含量3個方面[31-32]。等位基因越豐富，遺傳雜合度數值越大，多態信息含量越高，則證明群體遺傳變異越高，更能夠適應自然環境變化[33]。本研究中通過9對微衛星引物檢測到雜交黃顙魚的平均有效等位基因(3.0640)大于母本黃顙魚(2.5300)，但低于父本瓦氏黃顙魚(3.7697)。雜交黃顙魚的平均觀測雜合度(0.4492)和平均多態信息含量(0.5696)均大于母本黃顙魚(0.2970和0.3803)，但小于父本瓦氏黃顙魚(0.7292和0.6746)，其原因可能是黃顙魚連續自交、選育所導致的多樣性水平下降[31]，也可能是受核質作用的影響[29]；同時雜交黃顙魚的雙親雌雄比例為200∶1，父本瓦氏黃顙魚的遺傳物質對雜交子代的貢獻率較低，也可能是影響雜交黃顙魚的遺傳多樣性較低的原因。另外多態性微衛星位點的選擇和樣本數量的大小也可能成為影響試驗結果的可能因素[34]。微衛星位點的遺傳變異程度可以用多態信息含量來描述，數值越高則遺傳變異越大，反之則變異小[28]。根據Botstein等[35]提出的劃分標準，多態信息含量>0.5的位點為高度多態性位點；0.25<多態信息含量<0.5的位點為中度多態性位點；多態信息含量<0.25的位點為低度多態性位點。本研究中黃顙魚群體的平均多態信息含量為0.3803，為中度多態性群體；瓦氏黃顙魚和雜交黃顙魚群體的平均多態信息含量分別為0.6746 和0.5696，均為高度多態性群體，說明雜交黃顙魚群體的遺傳變異度較大，具有較為豐富的遺傳多樣性，有一定的雜交優勢和良種選育潛力。同樣的，利用微衛星標記分析魚類雜種優勢在斑鱖(Sinipercascherzeri)、鱖魚(S.chuatsi)以及斑鱖(♀)×鱖魚(♂)雜交一代、雜交二代群體遺傳特征分析中有所體現[28]，其結果顯示雜交一代、雜交二代群體的遺傳雜合性高于雙親斑鱖與鱖魚；紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)、菊黃東方鲀(T.flavidus)及其雜交子代的遺傳特征分析結果顯示，雜交子代的遺傳多樣性高于雙親[36]；紅鰭笛鯛(Lutjanuserythopterus)與千年笛鯛(L.sebea)的雜交一代也具有遺傳多樣性高的優勢[11]。

遺傳距離的大小反映了不同群體間親緣關系的遠近[37]。雜交親本間遺傳差異越大、親緣關系越遠，其后代雜種優勢越明顯[25]。本研究的黃顙魚和瓦氏黃顙魚兩個親本的遺傳距離高達4.4568，遺傳差異很大，理論上二者雜交可以產生具有優勢特征的雜交品種。也有報道稱，通過黃顙魚(♀)與瓦氏黃顙魚(♂)雜交得到的子代個體較大，生長速度較快，當年苗種即達商品規格，適應性強[1,5]，是具有雜交優勢的品種，其結果也印證了本研究。本研究的雜交黃顙魚與母本黃顙魚的遺傳距離較小(0.9006)，而與父本瓦氏黃顙魚的遺傳距離偏大(1.8195)，表明雜交黃顙魚與母本黃顙魚的親緣關系更近，遺傳上更偏向母本。這與李镕等[8，38]的形態分析研究結果一致，表明黃顙魚對雜交子代的貢獻率可能大于瓦氏黃顙魚，這點也可能間接證明了雜交黃顙魚的形態(如體色)與母本黃顙魚更接近?？傮w來說，雜交黃顙魚繼承了雙親的遺傳特征，但偏向于母本黃顙魚。