HPLC法測定瑞戈非尼的有關物質

董海霞，蔡連輝，張曼紅，劉建洋

(山東標準檢測技術有限公司，山東 濟南 250101)

瑞戈非尼(regorafenib，1)[1]，化學名為4-[4-({[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰}氨基)-3-氟苯氧基]-N-甲基吡啶-2-甲酰胺一水合物，拜耳醫藥保健有限公司生產的瑞戈非尼片(商品名：STIVARGA?)，2012年9月在美國上市[2]，用于治療先前接受過伊馬替尼和舒尼替尼治療的局部晚期，不能手術切除或轉移性胃腸道間質瘤(GIST)患者。1是由德國拜耳公司研發的一種具有口服活性的新型二苯脲類廣譜激酶抑制劑，通過抑制促進腫瘤組織生長的多種酶(包括VEGFR-1、VEGFR-、VEGFR-3、PDGFR-β、FGFR1和c-KIT等)，進而起到抑制腫瘤血管生成和腫瘤細胞增殖的作用[3-5]。本試驗建立了反相高效液相色譜法(RP-HPLC)測定瑞戈非尼的有關物質，此法靈敏度高，專屬性強，準確度高，可用于瑞戈非尼的質量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀(包括四元泵、自動進樣器、PDA檢測器和Empower 3工作站)；QUINTIX125D-1CN電子分析天平(賽多利斯公司)；FE-28臺式酸度計(梅特勒-托利多儀器)。

1.2 試藥

瑞戈非尼樣品(批號：170628、170714、170726)，由本公司生產；雜質A對照品(批號：ZA170301，含量：98.3%，化學名：4-(4-氨基-3-氟)苯氧基-N-甲基-2-吡啶羧酰胺)；雜質B對照品(批號：ZB170401，含量：99.3%，化學名：1,3-二(4-氯-3-三氟甲基苯基)脲)；雜質C(批號：ZC170301，含量97.8%，化學名：4-[2-氟-4-[2-(甲胺酰基)吡啶-4-氨基]苯氧基]-N-甲基-吡啶-2-酰胺)；雜質D對照品(批號：ZD170401，含量：99.3%，化學名：4-氯-3-(三氟甲基)苯胺)；雜質E對照品(批號：ZE170301，含量：96.0%，化學名：4-(4-(3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)脲基)-3-氟苯氧基)-2-甲胺?；拎?1-氧化物)均為本公司自制；乙腈(色譜純，ASTOON，4L/瓶)；醋酸銨(色譜純，飛世爾，500g/瓶)；水為市售純凈水(杭州哇哈哈集團)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性

色譜柱Gemini C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，以0.05 mol·L-1醋酸銨溶液-乙腈(80:20)為流動相A，以0.05 mol·L-1醋酸銨溶液-乙腈(10:90)為流動相B，梯度洗脫(0～10min，70%A；10～12min，70%A→48%A；12%～35min，48%A；35～40min，48%A→15%A；40～50min，15%A；50～60min，15%A→70%A；60～65min，70%A)，流速1.0mL·min-1，柱溫35℃，檢測波長261 nm，進樣量20μL。在本色譜條件下，瑞戈非尼保留時間約為31.5min，雜質A保留時間約為6.8min，雜質B保留時間約為47.4min，雜質C保留時間約為7.3min，雜質D保留時間約為19.7min，雜質E保留時間約為20.9min，理論板數按瑞戈非尼峰計為10157，雜質E與瑞戈非尼的分離度為25.2；雜質A與雜質C的分離度為1.8；雜質D與雜質E的分離度為4.6，均分離完全。色譜圖見圖1。

圖1 專屬性試驗色譜圖

2.2 專屬性試驗

精密稱取瑞戈非尼粉末約20 mg，置50 mL量瓶中，進行不同條件下的降解試驗。酸破壞：加2 mol·L-1鹽酸溶液，100℃水浴條件下，放置2 h后，用堿中和；堿破壞：加2 mol·L-1氫氧化鈉溶液，100℃水浴條件下，放置3 h后，用酸中和；氧化破壞：加入30%過氧化氫溶液2 mL，100℃水浴條件下，放置12 h；高溫破壞：100℃水浴條件下，放置8 h；光照：在光強度4500lx下照射24 h。按“2.1”項的色譜條件進樣，用DAD檢測器掃描，得到色譜圖，見圖2、3。圖譜顯示產生的降解物質與主峰的分離度均大于1.5，能完全分離，表明該法的專屬性較強；根據DAD掃描的光譜圖，可知主峰為單一純度峰，且主成分和主要降解產物在檢測波長261 nm處均有吸收，說明在選定色譜條件下可以檢出樣品中可能存在的雜質。

圖2 酸、堿與高溫破壞色譜圖

圖3 未破壞、氧化及光照破壞色譜圖

2.3 線性試驗及校正因子

配制相當于供試品溶液濃度的0.02%、0.04%、0.06%、0.1%、0.15%的線性溶液，按“2.1”項的色譜條件進樣，記錄色譜圖。以峰面積A為縱坐標，濃度C為橫坐標，進行線性回歸；同時計算各雜質的檢測限(LOD)、定量限(LOQ)和校正因子，結果見表1。

表1 線性試驗結果及LOD、LOQ和校正因子

注：[1]r>0.999。

2.4 精密度和穩定性試驗

取樣品，由2名實驗人員在不同時間、不同設備上，分別測定6份供試品溶液；計算得雜質A、B、C、D、E、最大單一雜質和總雜質含量的RSD(n=12)分別為2.6%、2.0%、3.5%、4.1%、2.8%、3.2%和1.1%。

取新鮮配制的對照品溶液和供試品溶液，室溫放置，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，記錄色譜圖，對照品溶液中主峰面積各時間點與零點比較變化值最大為3.1%，均小于5.0%；供試品溶液中各雜質含量和總雜質含量變化均小于0.02%，表明，室溫條件下，對照品溶液和供試品溶液均在24h內穩定。

2.5 回收率試驗

取瑞戈非尼適量，加溶劑制成每1 mL中含0.4 mg的溶液，分別加入0.2%、1.0%與1.5%的雜質對照品溶液，按“2.1”項的色譜條件進樣，記錄峰面積，按外標法以峰面積計算。結果雜質A、B、C、D、E的平均回收率(n=9)分別為98.4%、102.7%、97.3%、97.9%、104.2%，RSD分別為1.3%、2.4%、2.8%、1.2%和1.5%。

2.6 樣品測定

取3批自制產品和1批原研藥，按“2.1”項下色譜條件進行試驗，雜質A、B、C、D、E分別按外標法以峰面積計算，其他雜質按主成分自身對照法計算。結果見表2。

表2 樣品測定結果/%

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

根據合成工藝中各起始原料、各中間體、雜質A、B、C、D、E、瑞戈非尼的紫外掃描圖譜及樣品強制降解試驗中的各降解產物的二極管陣列檢測器的掃描圖譜，發現使用261 nm波長進行檢測時，可將各雜質成分有效檢出，分離度良好。故最終選擇261 nm為本試驗檢測波長。

3.2 流動相的選擇

本試驗分別以乙腈-0.05mol·L-1醋酸銨溶液不同比例的溶液作為流動相A和B，并對流動相系統的洗脫方式進行了考察。在等度洗脫條件下主峰與相鄰雜質分離度不理想，個別雜質出峰較晚；而采用梯度洗脫時，主成分與各雜質均能達到有效分離，且各峰純度都達100%。故本試驗最終選擇該流動相系統和梯度洗脫程序進行洗脫。

3.3 雜質A、B、C、D、E的定量

本試驗中將雜質A、B、C、D、E作為已知雜質進行研究，雜質A、C、D、E的校正因子均不在0.9～1.1范圍內。為準確計算樣品中雜質含量，各已知雜質均按外標法，以峰面積計算，未知雜質按自身對照法進行定量計算。