MSPD-HPLC法測定金線吊烏龜中千金藤素

汪亞勤, 殷嘉珺, 謝道濤, 康 云, 翁偉宇, 黃建明*

（1.復旦大學藥學院, 上海 201203； 2.華東理工大學, 上海 200237）

MSPD-HPLC法測定金線吊烏龜中千金藤素

汪亞勤1, 殷嘉珺1, 謝道濤1, 康 云1, 翁偉宇2, 黃建明1*

（1.復旦大學藥學院, 上海 201203； 2.華東理工大學, 上海 200237）

目的 建立基質固相分散-高效液相色譜法 （MSPD-HPLC） 測定千金藤屬植物金線吊烏龜塊根中千金藤素的量。 方法 樣品的前處理采用 MSPD法， 以堿性氧化鋁為吸附劑， 甲醇為洗脫溶劑。 HPLC分析采用 Phenomenex Gemini C18色譜柱 （250mm ×4.60 mm， 5 μm） ， 流動相為乙腈-緩沖液 （0.5%三乙胺水溶液用磷酸調節 pH至 10.7） ， 體積流量 1.0mL/min， 檢測波長 282 nm， 柱溫 40 ℃。 結果 千金藤素在 14.88 ～238 μg/mL范圍內呈良好線性關系（r=0.999 4）， 平均回收率為 98.2%， RSD 3.0% （n=6）。 結論 所建 MSPD-HPLC法簡便、 快速， 可用于金線吊烏龜中千金藤素的定量分析。

金線吊烏龜;千金藤素;基質固相分散法;高效液相色譜法

金線吊烏龜 Stephania cepharantha Hayata為防己科千金藤屬植物，又名頭花千金藤、白藥、山烏龜等，其塊根為民間常用藥材，味苦性寒，具有清熱解毒、消腫止痛的功效，主治咽喉腫痛、風濕痹痛、 腹痛 瀉 痢 等 疾 ?。?-2］。 該 植 物 塊 根 富 含 生 物堿， 其中千金藤素 （ cepharanthine， 又名頭花千金藤堿）是重要的活性成分，具有升高白細胞、抗炎、 抗癌、 抗 HIV-1 和增強免 疫 調 節 等 作用［2-9］。金線吊烏龜中千金藤素的測定方法有 TLCS 和HPLC法， 樣品前處理先以冷浸或回流法提取，再以有機溶劑萃取生物堿， 均較耗時、 繁復［10-11］。

基質 固 相 分 散 法 （ Matrix solid-phase dispersion， MSPD） 是一種新型的樣品處理技術， 該法將提取和凈化過程合二為一，從而簡化了操作步驟， 縮短了處 理時間［12-15］。 本 實 驗建立了 MSPDHPLC法測定金線吊烏龜中的千金藤素， 該法簡便、快速、準確、重復性好，為金線吊烏龜的質量評價提供了參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1200 型高效液相色譜儀 （ 安捷倫科技有限公司）， 10 管固相萃取裝置 （安捷倫科技有限公司），Thermo fisher FE20 pH計 （ 梅特勒-托利多儀器有限公司）， EL104 電子天平 （上海梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2 試藥 金線吊烏龜樣品 1 和 2 的產地均為四川，采集時間分別為 2010 年 11 月和 2011 年 10月，經復旦大學藥學院康云博士鑒定為金線吊烏龜S.cepharantha Hayata.的干 燥塊 根， 憑證標本保存于復旦大學藥學院生藥學教研室。千金藤素對照品 （中 國 藥 品 生 物 制 品 檢 定 所， 批 號111647200301）。 堿性氧化鋁 （150 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司）， C18和硅膠 （40 ～50 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司）。 甲醇 （色譜級，江蘇漢邦科技有限公司）; 乙腈 （色譜級，中國醫藥集團上?；瘜W試劑公司）; 超純水 （ 美國 Millipore公司的 Milli-Q超純水系統制得）; 其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 采用 Phenomenex Gemini C18色譜柱 （250 mm ×4.60 mm， 5 μm）， 流動相為乙腈-緩沖液 （0.5%三乙胺水溶液用 10%磷酸調節 pH至 10.7） （70 ∶30）， 體積流量 1.0 mL/min， 檢測波長 282 nm， 柱溫 40 ℃， 進樣量 20 μL。該色譜條件下對照品和供試品的色譜圖 （圖1） 顯示， 千金藤素分離度良好、峰形對稱。

2.2 對照品溶液的制備 取千金藤素對照品適量，精密稱定，用甲醇配制成 2.38 mg/mL的對照品貯備液。

2.3 供試品溶液的制備 取藥材干燥粉末 （過 60目篩） 0.25 g， 精密稱定， 置玻璃研缽中， 加入堿性氧化鋁 1 g，用玻璃研杵研磨 5min， 形成細膩勻質的藥材-填料混合粉末。將混合粉末轉移至墊有篩板的固相萃取小柱中，頂部蓋上另一篩板并壓實，用甲醇 8 m L洗脫，收集洗脫液， 定容至10 m L， 離心 （10 000 r/min， 5 min）， 取上清液，即得。

圖1 千金藤素對照品 （A） 和金線吊烏龜供試品 （B） 的 HPLC圖譜Fig.1 HPLC chrom atogram s of cepharan thine（A） and S.cepharantha （B）

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 將 “2.2” 項下的千金藤素對照品貯備溶液用甲醇稀釋成 238、 119、 59.5、29.75、 14.88 μg/mL的對照品工作溶液，分別進樣分析。 以質量濃度 （C， μg/mL） 對峰面積 （A）進行線性回歸， 得回歸方程 A=12.33 C+17.48，相關系數 r=0.999 4， 表明千金藤素在 14.88 ～238 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.4.2 檢測限 將千金藤素對照品貯備溶液用甲醇稀釋成一定質量濃度， 作 HPLC分析。 按照信號噪音比 （S/N） ≥ 3 確定千金藤素的檢測限為0.97 μg/mL。

2.4.3 精密度試驗 取 238、 59.5、 14.88 μg/m L的千金藤素對照品溶液在確定條件下分析。每個質量濃度日內測 3 次， 連續測3 日。 日內測定的 RSD分別為 0.4%、0.4%、 0.9%， 日間測定的 RSD分別為 2.3%、 2.4%、 1.4%。 結果表明， 儀器的精密度良好。

2.4.4 重復性試驗 取金線吊烏龜 1 號樣品 0.25g 6 份， 按 “2.3” 項下方法制備供試品溶液進樣分析。 結果， 千金藤素的 RSD為 4.7% （n=6），方法的重復性良好。

2.4.5 穩定性試驗 取貯存于0 ～4 ℃的對照品溶液 （238、 59.5、 14.88 μg/mL） 和 供 試品溶液，在 0、 24、 48 h 分別進樣分析， 測得對照品溶液的RSD分別為 2.7%、 2.4%、 1.7% （n=3）， 供試品溶液的 RSD為1.1% （n=3）， 顯示對照品和供試品溶液中的千金藤素至少在48 h內穩定。

2.4.6 加樣回收率試驗 取金線吊烏龜 1 號樣品0.125 g 6 份， 精密稱定， 準確加入 125 μL對照品儲備液 （2.38 mg/m L）， 按 “2.3” 項下方法制備供試品溶液，進樣分析，計算加樣回收率，結果見表1。

表 1 千金藤素的加樣回收率 （n=6）Tab.1 Results of recovery tests for cepharanthine（ n=6）

2.5 樣品測定 按 “2.3” 項下方法制備供試品溶液， 進行 HPLC分析， 金線吊烏龜 1 號和 2 號樣品中 千 金 藤 素 的 量 分 別 為 （ 2.303 ± 0.067 ）mg/g， （1.708 ±0.022） mg/g（n=3）。

3 討論

3.1 樣品處理方法的選擇與優化 比較了 MSPD法 （ ＜10 min）、 索氏提取法 （6 h） 和超聲提取法（30 min）， 3 種方法對千金藤素的提取率無差別，但是索氏提取法和超聲提取法需要較大量的提取溶劑， 耗時長， 且提取液的顏色較深; 而 MSPD法消耗的溶劑量少，耗時短，且提取液的顏色較淺，提示樣品較潔凈。 因此， 本實驗選擇 MSPD法。

同時對 MSPD法的研磨時間、 吸附劑與洗脫劑進行了優化。 研磨是 MSPD法與常規固相萃取法（ solid-phase extraction， SPE） 的 區 別 步 驟 之 一。MSPD法將固體樣品與吸附劑研磨混合后即可提純; 而 SPE需用合適的方法提取出目標成分后才可進行。研磨可使樣品均化、細胞破裂、待測成分充分吸附到載體上，因而研磨時間的長短對提取效果有影響。 考察了研磨 1、 3、 5 min 的結果， 5 min可以得到高且穩定的提取率，因此本實驗選擇研磨5 min。

MSPD法中的吸附劑對千金藤素的提取效果有顯著影響。 以堿性氧化鋁、 C18和硅膠為吸附劑時，提取得到的千金藤素分別為 （2.303 ± 0.067）mg/g、 （2.057 ±0.071）mg/g、 （1.960 ±0.192）mg/g（n=3）， 堿性氧化鋁的提取效果最佳。

洗脫劑考察了甲醇、 80%甲醇、 0.125%氨化甲醇，3種溶劑對千金藤素的提取率無顯著差別，本實驗選擇最簡便的甲醇為洗脫劑。

洗脫劑甲醇的體積比較了 6、8、10 mL，6 mL洗脫所得千金藤素的穩定性欠佳， 8 和10 m L的洗脫效果無顯著差別， 因此選擇8 mL為洗脫劑體積。

3.2 色譜條件的優化 生物堿的峰形和分離度受流動相pH值的影響較大， 因而實驗中首先考察了pH 7 ～11 的水相，結果， pH在 10.5 以上時， 千金藤素的峰形對稱、 分離度較好，本實驗以 pH 10.7 的三乙胺-硫酸緩沖液作為水相。 其次， 比較了甲醇和乙腈兩種有機相，乙腈的分離效果更好且柱壓較低，因此選擇乙腈作為有機相。

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Determ ination of cepharanthine in Stephania cepharantha Hayata by MSPD-HPLC

WANG Ya-qin1， YIN Jia-jun1， XIE Dao-tao1， KANG Yun1， WENG Wei-yu2， HUANG Jian-ming1*

（1.School of Pharmacy， Fudan University， Shanghai 201203， China;2.School of Pharmacy， East China University of Science and Technology，Shanghai200237， China）

AIM To establish a matrix solid-phase dispersion （ MSPD） extraction method followed by HPLC for the determination of cepharanthine in Stephania cepharantha Hayata.METHODS The sampleswere preparedby an optimized MSPD procedure using basic alumina as the sorbent and methanol as the elution solvent.The HPLC separation was carried out on a Phenomenex Gemini C18column （250 mm ×4.60 mm， 5 μm） with an isocratic mobile phase consisting of acetonitrile-0.5%triethylamine aqueous solution adjusted to pH 10.7 with phosphoric acid （70 ∶30）.The flow rate was1.0 mL/min， the detection wavelength was setat282 nm， and the column temperature was 40 ℃.RESULTS The calibration curve of cepharanthine was linear in the range of 14.88 ～238 μg/mL（r=0.9994）.The average recovery was 98.2%with RSD 3.0% （n=6） .CONCLUSION The MSPD-HPLCmethod is simple， rapid， and applicable to the quantification of cepharanthine in S.cepharantha.

Stephania cepharantha;cepharanthine;matrix solid-phase dispersion;HPLC

R284.1

:A

1001-1528（2014）12-2557-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.025

2014-08-01

國家自然科學基金項目 （31100238）; 復旦大學青年教師科研能力提升項目 （20520133180）

汪亞勤 （ 1983—）， 女， 實驗師， 主 要從 事中 藥質量 評價 與 活性成 分 的研究。 Tel:13585543024， E-mail:wangyq1219@ 126.com

*通信作者: 黃建明， 女， 副教授， 碩士生導師， 主要從事中藥質量評價與活性成分的研究。 Tel: （ 021） 51980132， E-mail:jmhuang @shmu.edu.cn