小麥中嘔吐毒素快速檢測方法比較*

謝婷婷，林秀，陳凌峰

（福建省糧油質量監測所，福建 福州 350012）

目前，基于大型儀器的檢測方法，由于儀器不具有便攜性、樣品前處理操作比較復雜、檢測需要的時間較長、檢測成本較高等原因無法滿足短時間內得出實驗結果和現場快速檢測的需求。快速檢測方法與大型儀器方法相比，是一種能夠將樣品前處理簡化以及短時間內能對相關的質量安全指標得出檢測結果的技術[1]。

近年來，糧食中真菌毒素的危害性受到廣泛關注，其檢測方法也越來越受到重視。嘔吐毒素（vomitoxin），又名脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON），它是一種由鐮刀菌屬產生的毒性代謝產物，主要污染小麥、大麥、燕麥、玉米等谷類作物[2]。

糧食中嘔吐毒素快速檢測方法有酶聯免疫吸附篩查法、膠體金快速定量法和時間分辨免疫層析法。酶聯免疫吸附法(ELISA法)是把抗原和抗體的特異性免疫反應和酶的高效催化作用有機結合起來的檢測技術[3]也是國標規定的篩查方法[4]。膠體金快速定量法是以膠體金層析免疫競爭為原理，以小分子化合物為檢測對象，運用側流技術發展起來的一種真菌毒素快速檢測方法[5-7]，它具有檢測速度更快、檢測成本較低，操作更簡單等優點。時間分辨免疫層析法(time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)是利用真菌毒素與熒光微球標記的特異性單克隆抗體反應，用時間分辨熒光免疫層析檢測儀測定反應產物中的熒光強度，前期的研究結果已證實該檢測方法可行[8]。

本文采用膠體金快速定量法、酶聯免疫吸附法、時間分辨熒光免疫層析法及高效液相色譜法檢測同一批小麥及其制品中嘔吐毒素，比較幾種快速檢測方法的準確性、成本以及便攜性等方面，以期為嘔吐毒素的快速檢測提供參考。

1 材料與儀器

1.1 試驗材料

隨機選取小麥若干份。

1.2 主要儀器

ROSA-M 真菌快速檢測儀：Charm Sciences 公司；

ROSA-FAST5 嘔吐毒素快速試紙條：Charm Sciences公司；

嘔吐毒素免疫親和柱：北京華安麥科科技有限公司；

高效液相色譜：島津LC-20A；

真菌毒素時間分辨熒光免疫層析檢測儀：江蘇蘇薇微生物研究有限公司；

電子天平：梅特勒-托利多AB204-L；

嘔吐毒素標準品：美國Sigma公司；

甲醇：色譜純；

1.3 試驗方法

1.3.1 分樣

按照GB 5491-1985《糧食、油料檢驗 扦樣、分樣法》的規定進行扦樣、分樣。

1.3.2 除雜

按照GB/T 5494-2008《糧油檢驗 糧食、油料的雜質、不完善粒檢驗》的規定去除樣品中的雜質。

1.3.3 高效液相色譜法測定小麥中嘔吐毒素

按照GB 5009.111-2016《食品安全國家標準 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測定》第2法 免疫親和層析凈化高效液相色譜法測定小麥中嘔吐毒素。

色譜條件：C18柱（5μm，250mm×4.6mm）；

流動相：V(甲醇)∶V(水)＝20∶80；

流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：50 μL；檢測波長：218 nm。

1.3.4 膠體金快速定量法測定小麥中嘔吐毒素

準確稱取10.00 g 試樣于100 mL具塞錐形瓶中，加入50.0 mL 試樣提取液，密閉，用渦旋振蕩器振蕩1～2 min，靜置后用濾紙過濾，或取1.0～1.5 mL混合液于離心管中，4000 r/min 離心1 min。取濾液或離心后上清液100 μL于另一離心管中，加入1.0 mL稀釋緩沖液，充分混勻待測。

將檢測條平放在45-孵育器凹槽中，打開加樣槽，準確移取300 μL待測溶液至檢測條加樣孔中，關閉孵育器蓋。孵育5 min后，取出檢測條觀察質控線和檢測線的顯色情況，必須出現清晰齊整的質控線即C線。若出現下述4種情況，視為檢測條無效：⑴ C線（質控線）不出現、彌散或嚴重不均勻；⑵T1或 T2線（檢測線）嚴重不均勻；⑶ 待測溶液掩蓋或模糊了T1、T2線或C線；⑷ 膠體金顯色微粒沒有通過T1、T2線或C線。

孵育完成后，選取讀數儀嘔吐毒素檢測頻道中“基質00”(MATRIX00)樣品測定類型進行測定，讀數儀顯示樣品中嘔吐毒素的含量。

1.3.5 酶聯免疫法測定小麥中嘔吐毒素

準確稱取5.0 g試樣于具塞三角瓶中，準確加入25.0 mL 60%甲醇水溶液，振蕩20 min，以定性濾紙快速過濾，收集濾液。取樣品提取液1 mL加水4 mL混勻即得待測樣液（稀釋系數25）。

將所需試劑從冷藏環境中取出，置于室溫（20～25℃）平衡1 h以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。控制溫度在20～25 ℃。

將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置,加入標準品或樣本50 μL到對應的微孔中，加酶標物50 μL/孔，再加入抗試劑50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25 ℃避光環境中反應30 min。小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌液250 μL/孔，充分洗滌4～5次，每次間隔10 s，在吸水紙上拍干。

加入底物液100 μL/孔，用蓋板膜蓋板后置25 ℃避光環境反應15 min。加入終止液50 μL/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450 nm處（建議用雙波長450/630 nm檢測），測定每孔OD值。

1.3.6 時間分辨熒光免疫層析法測定小麥中嘔吐毒素

準確稱取2.0 g樣品至50 mL離心管中，準確加入20 mL水加蓋，混勻。將離心管放置漩渦混勻器上渦旋提取2 min，于離心機4000 r/min離心5 min，得上清液。

將時間分辨熒光免疫層析定量檢測卡從冷藏柜取出，平衡至室溫后，將其平放，用移液器定量吸取50 μL上清液加入950 μL嘔吐毒素稀釋液中，充分混勻，吸取100 μL此混合液垂直滴加于加樣孔中，于20～25 ℃室溫條件下進行反應，開始計時。反應10 min后，將檢測卡放入時間分辨熒光免疫層析檢測儀中。讀數完成后，自動計算待測樣品中嘔吐毒素含量。若待測樣品中嘔吐毒素含量超過檢測線性范圍，應使用提取液對其濾液進行稀釋后，吸取100 μL加入稀釋液中，重新進行讀數。

1.3.7 數據分析

應用 Excel 軟件進行數據處理進行統計分析。

2 結果與討論

將高效液相色譜法的測定結果作為認定值，3種快速檢測方法的測定結果與之比較，按以下公式進行計算。

正確度(%)=檢測值/認定值×100%

2.1 膠體金快速定量法

膠體金快速定量法檢測小麥中嘔吐毒素，其結果與液相色譜法測定的結果相對比，正確度范圍在102.9%～140.8%之間，平均為121.1%，結果見表1。膠體金快速定量讀數儀中內含標準曲線，只需校準，大大避免了試劑對操作人員的危害。此方法要求條件低，操作簡單，檢測時間較短。與高效液相色譜法相比較，檢測數據正確度也較高。

2.2 酶聯免疫法

酶聯免疫法檢測小麥中嘔吐毒素，其結果與液相色譜法測定的結果相對比，正確度范圍在92.6%～134.6%之間，平均為105.8%（表2）。

從上表可以看出，酶聯免疫分析法作為傳統的小麥嘔吐毒素篩選方法，其檢測數據相對較準確，與高效液相色譜法相比，差值較小。同時其檢測數據較為穩定，但是在操作過程，其要求的實驗環境溫度等因素也相對較高一些。

2.3 時間分辨免疫層析法

時間分辨免疫層析法檢測小麥中嘔吐毒素，其結果與液相色譜法測定的結果相對比，正確度范圍在93.9%～135.7%之間，平均為108.0%（表3）。

從表3可以看出，與高效液相色譜法相比，時間分辨免疫層析法檢測小麥中嘔吐毒素的檢測結果正確度較高。在其操作的過程中，檢驗步驟簡單，儀器本身自帶有標準曲線，減少了試劑毒性對人體的危害。

表1 膠體金快速定量法正確度分析

表2 酶聯免疫法正確度分析

表3 時間分辨免疫層析法正確度分析

表4 幾種小麥嘔吐毒素檢測方法的檢測時間、成本、試劑毒性比較

2.4 檢測時間、成本、毒性的比較

從表4可以看出，與傳統的大型儀器方法（高效液相色譜法）相比較，快速檢測方法有其明顯的優勢。對比檢測時間、成本、毒性以及對操作人員的要求這幾方面，快速檢測方法具有短時間、低成本、健康環保以及便攜性等優點。其中，膠體金快速定量法和時間分辨熒光免疫層析法是近年發展起來比較實用的快速檢測方法，它們在檢測小麥中嘔吐毒素所需的檢測時間是相對較短的，其試劑毒性對操作人員的影響也較小，操作簡單，容易攜帶至現場進行檢測。

3 結論

為了滿足日益增長的糧食質量安全現場快速檢測的需求，糧食快速檢測方法也越來越被人們關注。膠體金快速定量法、酶聯免疫法和時間分辨熒光免疫層析法這3種快速檢測小麥嘔吐毒素的方法，均具有良好的正確度，膠體金快速定量法和時間分辨熒光免疫層析法這2種方法的儀器適用于直接攜帶至現場進行快速篩查，成本較低，操作較為簡單。酶聯免疫法雖然操作簡單，但是受到儀器以及環境溫度的限制，更適用于進行初步篩查后的進一步確證。

在糧食收購期間，現場入庫把關大量樣品的快速初篩可根據實際需要選擇合適的快速檢測方法，更能有效地完成糧食收購工作。