虎眼萬年青愈傷組織培養的研究

趙栢翎 張瑋 夏辰旭 關鳳濤 楊國會

【摘 要】以虎眼萬年青子鱗莖為外植體，以MS培養基為基本培養基，附加6-BA及NAA，對其愈傷組織的生長情況進行研究。試驗結果表明：適于愈傷組織誘導的培養基為MS+1.5mg/LNAA+1.5mg/L6-BA，適宜的繼代培養基為：MS+1.5mg/LNAA+1.5mg/L6-BA，形成的愈傷組織質地疏松，顏色淺黃而透明，形成易分散的顆粒。在25℃，130r/min，600Lx 12h的循環光照下在MS+2，4-D 3.0mg/L+NAA2.0mg/L 的液體優化培養基中培養，18天后，篩選獲得最佳虎眼萬年青的懸浮細胞系。

【關鍵詞】虎眼萬年青;愈傷組織;懸浮細胞系

虎眼萬年青（Ornithogalum caudatum Ait）為百合科虎眼萬年青屬常綠多年生草本植物的干燥全草，又名胡連萬年青、海蔥、葫蘆蘭、珍珠草、鳥乳花，屬常見的觀賞花卉，原產于非洲南部，我國各地廣泛栽培[1]。虎眼萬年青有極高的藥用價值，虎眼萬年青球莖中含有大量的生物堿及化學成分，已測出的化學成分有27種之多，藥理學研究表明虎眼萬年青中的虎眼萬年青皂苷OSW -1對肺癌、乳腺癌有明顯的抗癌活體，體外抗p338淋巴細胞白血病活性結果表明，0SW - 1是常見抗癌藥物喜樹堿、阿霉素、紫杉醇抗癌活性的10～100倍，而且對正常細胞沒有毒性，因此，是一種極具開發潛力的中草藥[2]。服用本品可以增強人體免疫功能，抑制腫瘤，預防高血壓、糖尿病、動脈硬化等疾病[3]。有研究表明，虎眼萬年青不僅是一種觀賞花卉，而且也是一種具有開發前景的藥用植物[4]。本項目主要進行虎眼萬年青細胞培養研究。經查新，目前關于虎眼萬年青細胞培養的研究方面的文獻資料還未見報道。為此，筆者著重研究不同激素配比的培養基對虎眼萬年青組織培養的研究，確定出最佳方案，為實現大規模生產化工廠化提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

虎眼萬年青子鱗莖，2018年1月采自吉林農業科技學院九站校區。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒 取虎眼萬年青子鱗莖，剝去表皮并用飽和洗衣粉侵泡1h，然后用自來水反復沖洗干凈，移入超凈工作臺，用75%的酒精浸泡50s，再用0.1%HgCl2溶液處理15min，無菌水沖洗3-5次。

1.2.2 培養基 愈傷組織誘導的初代培養基共9種配比，分別記做：A1：MS+6-BA0.5mg/L+NAA1.5mg/L;A2：MS+6-BA1.0mg/L+NAA1.5mg/L ; A3：MS+6-BA1.5mg/L+NAA 1.5mg/L;A4：MS+6-BA0.5mg/L+NAA 2.0mg/L;A5：MS+6-BA1.0mg/L+NAA 2.0mg/L ;A6：MS+6-BA1.5mg/L+NAA 2.0mg/L ;A7：MS+6-BA0.5mg/L+NAA 2.5mg/L;A8：MS+6-BA1.0mg/L+NAA 2.5mg/L;A9：MS+6-BA1.5mg/L+NAA 2.5mg/L;誘導愈傷組織的繼代培養基共4種配比，分別記做：B1：MS+6-BA1.5mg/L+NAA1.5mg/L;B2：MS+6-BA0.5mg/L+NAA2.5mg/L;B3：MS+6-BA1.0mg/L+NAA2.5mg/L;B4：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L;建立細胞懸浮體系的液體培養基共3種配比，分別記做：C1：MS+2，4-D 3.0mg/L+NAA1.5mg/L;C2：MS+2，4-D 3.0mg/L+NAA2.0mg/L;C3：MS+2，4-D 2.0mg/L+NAA2.5mg/L。

1.2.3 接種和培養 將每個子鱗莖切成8塊接種到培養基上，每個培養瓶接種2塊，每個處理接種10瓶，共90瓶，形態學下端插入培養基，培養溫度（25±2℃），進行暗培養。培養20d后，選擇誘導率高的愈傷組織繼續進行繼代培養，每瓶接種2塊，每個處理接種20瓶，共80瓶，培養溫度（25±2℃），進行暗培養，20d接種到液體培養基上進行搖床培養，接種量為10g/130mL，溫度25℃，轉數130r/min，600Lux，12h循環光照，裝液量130mL/250mL，培養18d，觀察愈傷組織生長狀況[5]。

2 結果與分析

2.1 不同激素配比濃度的培養基對虎眼萬年青愈傷組織誘導的影響。

在相同條件下（基本培養基相同，培養條件相同），當激素NAA為1.5 mg/L時，隨著6-BA濃度梯度的增加，愈傷組織的平均誘導率逐漸增加;當激素NAA為2.0 mg/L時，隨著6-BA濃度梯度的增加，愈傷組織的平均誘導率增加不是很明顯，誘導率增幅較小;激素NAA為2.5 mg/L時，隨著6-BA濃度梯度的增加，愈傷組織的平均誘導率出現下降趨勢。試驗數據采用SPSS 13.0軟件進行分析，由表1-2可知，A1與A4、A5、A6、A2、A9差異不顯著，A1與A7、A8差異顯著，A3與A7、A8差異顯著，A1與A3差異極顯著，即最佳培養基為A3：MS+6-BA1.5mg/L+NAA1.5mg/L ，在A3中平均誘導率達到96.67%，效果最好，為繼代時形成質地疏松的愈傷組織打下基礎。

2.2 不同激素配比濃度的培養基對虎眼萬年青愈傷組織生長的影響 。

在相同條件下（基本培養基相同，外界培養條件相同），當激素NAA為2.5mg/L時，6-BA濃度由0.5mg/L增加至1.0mg/L，愈傷組織的平均誘直徑減少了1.49mm;當激素6-BA的添加量是NAA添加量20倍時，顯然抑制了愈傷組織的生長;當NAA的濃度與6-BA的濃度比為1：1時，最適合其生長。試驗數據采用SPSS 13.0軟件進行分析，由表2可知，B1與B4、B3極顯著，B1與B2顯著，B2與B4顯著。可得最適合愈傷組織生長的培養基是B1 ：MS+1.5mg/LNAA+1.5mg/L6-BA，在液體培養中有優勢，增長效果明顯。

在愈傷組織繼代的第20天時，B1中有較大的球狀顆粒，因質地松軟可在液體懸浮培養中有較大的明顯;B4中NAA濃度小于6-BA濃度，不適宜愈傷組織的生長而且較其他培養基相比生長緩慢，幾乎不形成顆粒，顏色偏綠。

2.3 不同激素配比濃度的液體培養基對虎眼萬年青愈傷組織懸浮體系形成的影響

愈傷組織在液體懸浮培養時起初生長極為緩慢，在第10天左右時，生長速度明顯增加，質地疏松的愈傷組織在懸浮培養時易分散，充滿整個培養基，體積逐漸變大，質地緊實的則在外圍直接長出小的、形狀不規則的愈傷組織，無分散現象。在液體培養的第18天時，經觀察，愈傷組織在C2中的分散顆粒最多，長勢最好;C3次之;而在C1中長勢最差幾乎無改變。因此，最適合愈傷組織的液體培養基是C2：MS+2，4-D 3.0mg/L+NAA2.0mg/L 。初步形成無菌懸浮體系，為下一步研究提供了可靠的理論依據。

3 結論與討論

植物激素雖用量極小，但是培養基中的關鍵物質，而且在植物組織培養中起著重要和明顯的調節作用。用于植物組織培養的激素包括生長素、赤霉素和細胞分裂素等。生長素的主要

作用在于誘導愈傷組織的形成、胚狀體的產生及試管苗的生根，需要注意的是在使用時要配合其他激素;細胞分裂素有促進細胞分裂和分化，延遲組織衰老，增加蛋白質合成，抑制頂端優勢，促進側芽生長并且可以改變其他激素作用的特點。

脫分化是植物組織培養環節中成敗的關鍵，為建立無菌體系打下良好的基礎，試驗研究過程中還發現外植體初代培養時間不宜過長，導致愈傷組織干癟，水分缺失，影響繼代。

在愈傷組織的培養過程當中，出現污染的現象不可避免。本實驗在繼代培養的第3天，有培養基出現污染情況，第一種污染現象是在試驗材料附近出現粘液狀物體，培養基變渾濁（圖3）;第二種不同污染現象是在第五天時，培養基出現顏色變化，部分呈現綠色，還有一部分為黑色塊狀，一直擴散到培養基最底部。經查閱文獻 ，得知前者為細菌污染，主要的來源是由于接種材料和工具滅菌不徹底;后者為真菌污染，主要來源于環境。

通過試驗初步確定虎眼萬年青形成愈傷組織初代培養最適培養基是MS+1.5mg/LNAA+1.5mg/L6-BA，繼代培養基為：MS+1.5mg/LNAA+1.5mg/L6-BA，液體懸浮培養基為MS+2，4-D 3.0mg/L+NAA2.0mg/L 。此結論為實現虎眼萬年青生產工廠化提供了一定的參考依據。

參考文獻：

[1] 張瑜，赫玉芳，南敏倫，等.虎眼萬年青研究進展[J].中南藥

學，2010，8，（04）：293-295.

[2] 肖沖，魚紅閃.虎眼萬年青皂苷的分離提取[J].大連輕工業

學院學報，2006，（02）：93-95.

[3] 丁景和.藥用植物學[M].上海：上海科學技術出版社， 1985.

[4] 楊國會，繆承陽，米春江.不同碳源對虎眼萬年青離體生長

的影響[J].安徽農業科學，2009，37，（34）：16767-16768.

[5] 楊國會，米春江，繆承陽.不同激素水平對虎眼萬年青組織

培養的影響[J].湖北農業科學，2011，50，（01）：183-184+188.