野花麥體內Pb對其生理性質的影響

李娟娟 梁寧剛 蔡卓 蔣翠文 葉丹妮

(廣西大學化學化工學院，南寧 530004)

野花麥屬多年生藥食同源的草本植物，具有殺菌消炎、清熱解毒、利尿消腫等功效[1～3]，對于治療熱痢、肺炎、濕疹等癥療效較好[4，5]。野花麥含有黃酮、蛋白質、多糖等成分，因而作為重要原料已廣泛應用于食品和藥品行業中。我國許多地區是野花麥分布區域，具有種植的潛力，然而野花麥的種植同樣面臨重金屬污染的威脅。Pb是植物生長的非必需元素，會通過大氣、水體及土壤等系統遷移至植物體內毒害其生長，還可通過食物鏈危害人體健康[6，7]。目前Pb對作物影響的研究已有報道[8]，但對草本中藥影響的研究還不多見。本文通過盆栽種植野花麥并進行鉛污染處理，測定植株可溶性蛋白、總黃酮及葉綠素的變化情況，從而探討Pb對野花麥生理性質的影響。

1 實驗材料與方法

1.1 試劑及實驗材料

牛血清蛋白(BSA)、考馬斯亮藍(G-250) 、蘆丁等標液均購于國藥試劑有限公司，L-半胱氨酸購于國藥集團化學制藥有限公司。實驗采用分析純等級試劑，去離子水為實驗用水。野花麥于2016年2月購自玉林中藥市場。

1.2 野花麥污染處理與采集

將野花麥幼苗(株高約30 cm)種植于盆中，深約5 cm，以水澆淋。待生長穩定，每天澆灌20 mL Pb(NO3)2溶液(濃度分別為250、500、1000、1500、2000 mg/kg)，期間保持光照、濕度等條件一致。記錄植株生長的狀況。

采集各生長時期(20、40、60d)的樣品，于105℃下烘干，冷卻后保存于密封袋中。

1.3 樣品的消解及Pb的測定

稱取烘干野花麥0.1000 g于100 mL燒杯內，加入20mL HNO3-HClO4(5∶1)，浸泡12h，于電熱板上加熱至白煙冒盡，再加HClO44mL加熱至無白煙，冷卻后溶液定容至50mL。用原子吸收法測定消解液中的Pb[9]。

1.4 可溶性蛋白含量的測定

將0.1000 g鮮樣放進研缽中，加入1.0 mL 0.50 mmol/L L-半胱氨酸、4.0 mL 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液( pH=7.8)、1.0 mL 0.05 mol/L Na2SO4及0.5克石英砂，搗碎成漿，于2000 r/min離心10 min，上清液導入比色管(15mL)；殘渣再次加入液體提取，合并所得上清液后定容，即為提取液。移取1.0 mL提取液和2.0 mL考馬斯亮藍(G-250)工作液，放入15mL比色管定容，測其595 nm的吸光度，進而算出可溶性蛋白含量[10，11]。

1.5 總黃酮含量的測定

在0.1000 g鮮樣中加入4mL 90%乙醇，超聲1h，用等量石油醚在分液漏斗中提取3次，再用旋轉蒸發儀于80℃蒸干，以60℃熱水溶解所得膠狀物并定容于50 mL，即為提取液。取10.0 mL提取液于50 mL容量瓶中，加入1.4 mL 0.72 mol/L NaNO2，1.4 mL 0.27 mol/L Al(NO3)3，靜置5 min，加入10.0 mL 1.5 mol/L NaOH，以30%乙醇定容后測定其545 nm的吸光度，并計算總黃酮含量[12，13]。

1.6 葉綠素含量的測定

將0.1000 g鮮樣放入研缽中，加5mL丙酮-乙醇-水 (4.5∶4.5∶1) 溶液，研磨，漏斗過濾，提取三次，所有濾液轉至50mL量瓶并定容。測定其663、645 nm的吸光度。將A663和A645代入式(1)、(2)、(3)中，得到Ca、Cb和Ct，再按式(4)算出葉綠素含量[14]。

Ca=12.7A663-2.69A645

(1)

Cb=22.9A645-4.68A663

(2)

Ct= Ca+ Cb=20.2A645+8.02A663

(3)

2 結果與分析

2.1 Pb在野花麥體內的累積分布

從表1數據中可以看出，各個部位Pb含量與澆灌液Pb濃度成正比，分布情況為莖部>根部>葉片。污染20 d時，野花麥的生長與未受污染時無差異。當40 d后，1000 mg/kg Pb處理下植株頂部葉片開始出現泛黃萎縮現象，而500 mg/kg Pb處理下植株仍保持翠綠。60 d時，澆淋500 mg/kg Pb溶液的植株有莖部萎縮、葉片枯黃的現象；250 mg/kg Pb處理下植株葉片枯萎但部分莖部仍有綠色。

2.2 Pb對可溶性蛋白含量的影響

隨Pb的增加野花麥各部位可溶性蛋白含量都有降低的趨勢(圖1)。20 d時葉片可溶性蛋白變化不大，但40 d時快速降低，說明葉片此時已受到Pb的明顯毒害(圖1a)；60 d 時葉片中可溶性蛋白含量迅速降低，此時Pb與可溶性蛋白含量的線性回歸方程是y=-37.532x+11.500，r=0.915，P<0.030，為顯著負相關。莖部可溶性蛋白在20 d時變化不大(圖1b)，40d開始下降，60 d則明顯下降。Pb與可溶性蛋白含量在60 d時的回歸方程是y=-5.471x+8.196，r= 0.941，P<0.017，呈顯著負相關。根部可溶性蛋白隨Pb污染的增加而不斷下降(圖1c)，60 d時兩者的回歸方程為y= -11.086x+12.165，r= 0.966，P<0.007，表現出顯著負相關。這與Pb對可溶性蛋白合成所形成的可能干擾有關。

表1 Pb在野花麥體內的分布(n=3)

圖1 Pb對野花麥葉片(a)、頸部(b)、根部(c)可溶性蛋白含量的影響

2.3 Pb對總黃酮含量的影響

葉片總黃酮含量隨Pb的增加而下降(圖2a)。60 d時葉片Pb與總黃酮含量的回歸方程是y= -6.962x+3.079，r= 0.912，P<0.031，為顯著負相關。莖部總黃酮隨著Pb增加所呈現的變化趨勢是先升高后降低 (圖2b)，說明莖部初期對Pb污染有一定的耐性，總黃酮升高，但40 d 后開始下降，60d后則迅速下降。Pb與總黃酮含量在60d時的回歸方程是y= -4.990x+4.845，r= 0.910，P<0.032，為顯著負相關。根部總黃酮隨Pb增加而快速下降 (圖2c)，60 d 時Pb含量與總黃酮含量的回歸方程為y= -4.999x+3.639，r= 0.942，P<0.016，為顯著負相關。這說明野花麥體內的Pb對黃酮的合成有明顯的抑制作用，Pb含量越高總黃酮含量下降越明顯。

圖2 Pb對野花麥葉片(a)、頸部(b)、根部(c)總黃酮含量的影響

圖3 Pb對野花麥葉片(a)、莖部(b)葉綠素含量的影響

2.4 Pb對葉綠素含量的影響

葉片葉綠素隨Pb的增大先是略有升高，然后下降(圖3a)，從40d開始葉綠素就明顯下降，同時葉片的外觀也變為枯黃。莖部葉綠素也是先升高后降低(圖3b)，40d后快速下降，60 d后急速降低，同時莖部也開始萎縮。數據分析顯示，Pb與葉綠素之間為顯著負相關，在60 d 時莖部、葉片葉綠素與Pb的回歸方程分別為y= -2.051x+1.731，r= 0.984，P<0.002和y= -14.463x+3.107，r= 0.935，P<0.020。可見，Pb能破壞植株合成葉綠素的機制，使植物的正常生理活動受到影響，Pb含量越高，危害越嚴重。

3 結論

在Pb污染的土壤上種植野花麥，Pb會進入其植物體內積累，積累量與Pb處理量成正比，積累分布的規律為莖部>根部>葉片。在Pb的毒害作用下，野花麥葉片、莖部和根部的可溶性蛋白、總黃酮及葉綠素等生理生化指標均不同程度地發生變化。在污染初期，低濃度的Pb刺激了野花麥自身的應激機制，造成野花麥莖部的總黃酮以及葉片和莖部的葉綠素等生理指標高于對照組，說明野花麥對Pb的毒害有一定的耐受能力。隨著Pb含量的增加，野花麥的各項生理指標均有明顯的下降。表明當野花麥體內Pb的毒害作用超過植物的耐受極限時，其自身的新陳代謝活動會受到破壞或抑制，正常生長受到損害，各部位的生理生化指標也受到影響。