RP-HPLC法測定淫羊藿根中朝藿定C的含量

黔南州食品藥品檢驗所，貴州 都勻 558000

淫羊藿根為小檗科植物箭葉淫羊藿Epimediumsagittatum(Sieb. Et Zucc.) Maxim、巫山淫羊藿EpimediumwushaneneseT.S.Ying、天平山淫羊藿EpimediummyrianthumSteam、柔毛淫羊藿EpimediumpubescensMaxim、氈毛淫羊藿EpimediumcoactumH.R.Liang et W.M.Yan、粗毛淫羊藿EpimediumacuminatumFranch及光葉淫羊藿Epimediumsagittatumvar. glabratum T.S.Ying的干燥根。具有補腎壯陽、祛風除濕的功效，用于腎虛陽痿、小便淋漓、咳喘、風濕痹痛[1]。淫羊藿含有多種有效成分，其主要有效成分為淫羊藿苷類黃酮化合物[2]，而其中的朝藿定C具有抗骨質疏松、抗癌、免疫增加等廣泛的藥理活性[3-4]。課題前期進行的預實驗結果顯示，朝藿定C的含量遠高于淫羊藿苷等其他類黃酮化合物，適宜定量分析。故選擇朝藿定C作為定量指標用于淫羊藿根藥材的質量控制。本文用反相液相色譜測定了11種貴州地產藥材淫羊藿根中朝藿定C的含量，可為淫羊藿根質量控制及相關醫藥產業提供理論根據參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 美國安捷倫1260高效液相色譜儀，上?？茖K250LHC超聲波清洗器，瑞士梅特勒托利多AG135和AL204電子天平，北京普析TU-1901紫外分光光度計。

1.2 材料 朝藿定C對照品(含量95.5%，批號：111780-201503，中國藥品生物制品檢定所)；乙腈(色譜純，批號：20170403，天津科密歐)；95%乙醇(分析純，批號：20161105，天津科密歐)；純凈水(批號：20171201，娃哈哈)；淫羊藿根樣品分別采集自貴州各地共11批(采集信息見表1)，樣品均經貴陽中醫學院何順志教授鑒定。樣品洗凈后曬干，粉碎，過三號篩，即得供試樣品，置于干燥器中保存。

表1 淫羊藿根樣品采集信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件[5-6]色譜柱：美國安捷倫Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(25∶75)；流速：1.0 mL/min，進樣量：10 μL；柱溫：30℃；檢測波長270 nm。理論板數以朝藿定C峰計算均不低于6000。

2.2 對照品溶液配制 精密稱取朝藿定C對照品50.94 mg置50 mL量瓶中，加50%乙醇超聲溶解并稀釋至刻度，作為對照品貯備液；精密量取對照品貯備液5 mL置20 mL量瓶中，加50%乙醇稀釋至刻度，即得(0.243 mg/mL)。

2.3 供試品溶液配制[5-6]取供試樣品約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇20 mL，稱定重量，放置過夜，超聲60分鐘(50 kHz)，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補足減失的重量，搖勻，經0.45 μm濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.4 峰純度考察 取對照品溶液、供試品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，按2.1項下的色譜條件，依法測定。朝藿定C峰的紫外掃描光譜表明：朝藿定C對照品的紫外掃描圖在200 nm、270 nm和320 nm處有最大吸收。3D圖譜顯示：200 nm波長處吸收大但雜質干擾較多，320 nm波長處干擾少但吸收較小，270 nm波長處吸收值較大且干擾少。供試品溶液中朝藿定C峰的紫外掃描圖與對照品峰的紫外掃描圖譜一致，且純度因子達到999以上。綜合以上考察，確定檢測波長為270 nm。

2.5 線性關系考察 精密量取2.2項下對照品貯備液1、2、4、6、8 mL分別置10 mL量瓶中，加50%乙醇稀釋至刻度，得一系列濃度級別的對照品溶液；精密吸取上述系列對照品溶液和對照品貯備液各10 μL，分別注入液相色譜儀，按2.1項下的色譜條件測定，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標，濃度(mg/mL)為橫坐標，進行線性回歸計算，朝藿定C回歸方程為：y=18219.1343x+26.8045，r=1.0000，結果表明朝藿定C在0.0973 ～0.9730 mg范圍內呈良好的線性關系。

2.6 精密度考察 精密吸取2.2項下朝藿定C對照品溶液10 μL，按2.1項下的色譜條件，注入液相色譜儀，連續進樣6次，測定峰面積，朝藿定C峰面積的RSD為0.14%，結果表明方法有良好的精密度。

2.7 穩定性考察 取同一供試品溶液分別于0、5、11、18 h進樣，進樣量10 μL，按2.1項下的色譜條件，測定朝藿定C峰面積，RSD為0.6%，表明供試品溶液在18 h內穩定性良好。

2.8 重復性考察 稱取同一供試品6份，按2.3項下方法配制供試品溶液，按2.1項下的色譜條件，進樣量10 μL，測定峰面積，計算含量。供試品中朝藿定C的平均含量為2.611%，RSD為0.4%，表明本方法重復性良好，符合定量標準要求。

2.9 加樣回收率試驗 精密稱取8份已測定含量的樣品0.1 g(朝藿定C含量為2.611%)，分別置具塞錐形瓶中，精密加入回收對照溶液20 mL，稱定重量，放置過夜，超聲60 min，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補足減失的重量，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，取續濾液，按2.1項下的色譜條件，進樣10 μL，記錄色譜圖，計算回收率。朝藿定C的平均回收率為102.3%，RSD為0.7%，表明本方法準確度良好，符合相關規定。結果見表2。

2.10 樣品含量測定 取不同產地供試樣品按2.3配制供試品溶液，分別進樣10 μL，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算含量。結果見表3。

表2 淫羊藿根中朝藿定C的回收率實驗結果

表3 淫羊藿根中朝藿定C含量測定結果 (%)

3 討論

為獲得準確的含量測定結果，本研究考察了浸泡過夜、浸泡過夜后超聲、浸泡過夜后水浴回流、浸泡過夜后超聲再水浴回流等四種不同的提取方法，結果表明，浸泡過夜后超聲效果為最佳，增加水浴回流步驟反而使朝藿定C含量結果降低。文獻報道[7]，朝藿定C(三糖苷)在高溫環境下會脫去一個鼠李糖后轉化為淫羊藿苷(二糖苷)，導致朝藿定C含量下降、淫羊藿苷含量升高。因此選擇浸泡過夜后超聲作為本實驗的提取方式。

實驗中有3個樣本分別為黔嶺淫羊藿和水城淫羊藿，不在貴州省淫羊藿根藥材標準收載的品種中，但作為貴州特有品種，本研究也對這3個樣本進行了含量測定，朝藿定C含量最低為0.86%，而標準收載的品種中，朝藿定C含量最低為0.89%。結果顯示，非標準品種中朝藿定C的含量也可以達到標準品種的含量水平，建議修訂淫羊藿根標準時增加收載品種，擴大貴州省淫羊藿根來源的覆蓋范圍。 淫羊藿根作為貴州省少數民族常用藥材，收載于《貴州省中藥材民族藥材質量標準》中，但標準中僅有一項性狀描述，不能有效控制藥材的質量。已有文獻研究對象多為淫羊藿藥材，按《中國藥典》一部定義為淫羊藿的干燥葉[8]。淫羊藿植株入藥部位不同，有效成份含量也有所差異，本研究可為淫羊藿根藥材的標準制定、醫療應用和質量控制提供數據參考。