佩蘭乙醇提取物對結腸癌RKO細胞的抑制作用研究

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1.遵義醫學院醫學與生物學研究中心，貴州 遵義 563000；2.貴州省普通高等學校特色藥物腫瘤防治重點實驗室，貴州 遵義 563000；3. 遵義醫學院基礎醫學院，貴州 遵義 563000

結腸癌是發病率較高的消化道惡性腫瘤之一，其年發病率和死亡率在逐漸升高。近年來針對腫瘤的綜合治療水平在不斷提升，但并不能有效遏制結腸癌的進展過程，結腸癌的死亡率仍居高不下。結腸癌的防治關鍵之一在于尋求有效抑制結腸癌細胞生長的藥物，探究潛在的天然產物作用對結腸癌的防治具有重要意義[1]。佩蘭為菊科澤蘭屬植物佩蘭EupatoriumfortuneiTurez的地上部分，又名香草、小澤蘭、大澤蘭、雞骨香，主產于華東、華南和西南等地區，味微苦，性寒，具有清熱解暑、芳香化濕、健胃開胃、殺蟲抑菌等功效[2]。現代藥理研究證明，佩蘭提取物具有抑菌、抗炎、降脂等作用[3-5]，但其抗腫瘤活性方面的研究報道很少，其抗腫瘤機制也不明[6-7]。本研究擬通過開展佩蘭乙醇提取物體外抑制結腸癌RKO細胞增殖進行初步研究，以期為后期發現佩蘭抗癌活性單體化合物奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器 3131型CO2培養箱、Multiskanspectrum全波長酶標儀(美國Thermo公司)、NikonYS100熒光顯微鏡(日本Nikon公司)、化學發光儀(美國伯樂公司)。

1.2 材料 佩蘭采自四川，由遵義醫學院醫學與生物學研究中心宋長偉博士鑒定，標本存放在醫學與生物學研究中心樣品保存室。RPMI-1640培養基(Hyclone公司)；胎牛血清(BI公司)；PBS粉末(BBI Life sciences公司)；SRB(Sigma公司)；Hoechst 33342染料(碧云天公司)；Bcl-2、Cleaved-caspase-3抗體(CST公司)。

1.3 結腸癌細胞株 人結腸癌RKO細胞購于上海吉凱公司。

2 方法

2.1 乙醇回流提取法獲得佩蘭乙醇提取物 稱取100 g佩蘭粉碎成粗粉，用75%乙醇浸泡2 h，回流提取3次，合并濾液減壓蒸餾得到佩蘭提取物浸膏。

2.2 SRB法檢測佩蘭乙醇提取物對結腸癌RKO細胞增殖抑制的影響 取對數生長的細胞，以2×104個細胞/孔的濃度接種于兩塊96孔板，一塊為對照板(T0)，一塊為實驗板；CO2培養箱中培養24 h后，對照板(T0)取出進行SRB染色，在530 nm波長下測定 OD值。染色流程如下：棄掉培養基，加入10% TCA固定液4℃條件下固定2 h；蒸餾水洗滌3次后自然晾干，每孔加入100 μL的4 mg/ mL的 SRB溶液，室溫下染色15 min；棄上清，1%的醋酸沖洗5次、甩干，每孔加入100 μL的10 mM Tris溶液。利用DMSO溶解佩蘭乙醇提取物后，用培養液稀釋成不同濃度(3 μg/mL、6 μg/mL、12.5 μg/mL、25 μg/mL)的藥液，且DMSO的終濃度不能超過0.5%。實驗板中加入上述配制好的不同濃度的藥液作為實驗組(T)，并設對照組(C)(加入200 μL培養基)，每組5個復孔，CO2培養箱中培養24 h后進行 SRB染色并測量OD值，按以下公式計算腫瘤生長抑制率。

2.3 倒置顯微鏡觀察佩蘭乙醇提取物對RKO細胞形態的影響 細胞接種于兩塊96孔板(2×104個/孔)，方法同2.1。實驗分為對照組(加入200 μL培養基)和實驗組(佩蘭乙醇提取物組終濃度為 5 μg/ mL、7.5 μg/ mL、10 μg/ mL)。細胞加藥培養48 h后，倒置顯微鏡下觀察 RKO細胞形態的變化。

2.4 Western blot 檢測Bcl-2和Cleaved caspase-3的表達 RKO細胞以 5×105個/孔接種于 6 孔板中，培養24 h 后，實驗分組：對照組(加入200 μL培養基)、佩蘭乙醇提取物組(終濃度為5 μg/mL、7.5 μg/mL、10 μg/mL)，培養48 h；提取細胞總蛋白，BCA測定蛋白樣品濃度，根據上樣量20 μg與5×蛋白上樣緩沖液混合，沸水煮沸10 min 使之變性。取樣品做 SDS-PAGE，全濕式電轉法將分離膠上的蛋白轉移到 PVDF 膜上； 封閉液封閉 1.5 h，分別加入一抗β-actin抗體、Bcl-2抗體、Cleaved caspase-3抗體，4℃孵育過夜，二抗(1∶1000)室溫孵育2 h；ECL化學發光檢測目的蛋白，在凝膠成像系統上測量灰度值并計算Bcl-2蛋白與Cleaved caspase-3蛋白的相對表達。

3 結果

3.1 佩蘭乙醇提取物對結腸癌RKO細胞生長抑制的影響 由圖1可知，佩蘭乙醇提取物濃度為3 μg/mL時已對RKO細胞的生長具有抑制作用；隨著佩蘭乙醇提取物濃度的增加，RKO細胞的生長抑制率增加；當濃度為25 μg/ mL時，RKO細胞的生長完全被抑制。

3.2 佩蘭乙醇提取物對RKO細胞形態的影響 與對照組比較，佩蘭乙醇提取物終濃度為5 μg/mL、7.5 μg/mL、10 μg/m作用48 h后，實驗組RKO細胞數量逐漸減少、細胞明顯皺縮變圓。如圖2所示。

3.3 佩蘭乙醇提取物對RKO凋亡過程中Bcl-2、Cleaved-caspase-3蛋白的變化 與對照組相比，當佩蘭乙醇提取物濃度從5 μg/mL至10 μg/mL，均能使Bcl-2蛋白的相表達量降低，降低程度隨著佩蘭乙醇提取物濃度的增加而增加；同時Cleavedcaspase-3蛋白相對表達量呈濃度依賴性增加。當佩蘭乙醇提取物濃度10 μg/mL時，Bcl-2和Cleavedcaspase-3蛋白與對照組相比有顯著差異。如圖3～4所示。

4 討論

我國2015年癌癥統計數據顯示結直腸癌病例在全部惡性腫瘤中均位居5，其中新發病例37.6萬，死亡病例19.1萬，已成為嚴重危害中國人健康的疾病[8]。化療仍舊是臨床治療結直腸癌的主要手段之一，尋求有效抑制癌細胞生長的藥物對腫瘤的防治具有重大的意義。佩蘭始載于《本草再新》，《神農本草經》列佩蘭于上品；1983年國外學者在佩蘭中發現了相對含量較高的揮發油、倍半萜烯類、萜醇類和黃酮類物質[6]；藥理學實驗證明佩蘭中的倍半萜內酯及黃酮類在體外實驗中均具有抗癌活性；1993年李美麗等[7]報道了菊科佩蘭屬植物含有雙稠吡咯啶生物堿，該生物總堿在體外試驗中表現出一定的抗腫瘤活性。目前，對佩蘭其他抗腫瘤活性成分及其機制的研究鮮見報道；為進一步明確佩蘭的抗腫瘤效果與機制，本研究以乙醇回流提取法獲得佩蘭乙醇提取物并作用于結腸癌RKO細胞，觀察佩蘭乙醇提取物對RKO細胞的抑制效應。結果顯示佩蘭乙醇提取物對RKO細胞的生長具有抑制作用，抑制效果隨著濃度增加而升高；倒置顯微鏡觀察顯示佩蘭乙醇提取物作用于RKO細胞后，細胞核發生皺縮或裂解等細胞凋亡的形態學改變；與細胞凋亡相關的抗凋亡蛋白Bcl-2的表達呈劑量依賴性降低，而活化形式的促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3的表達則呈劑量依賴性降低。以上結果提示佩蘭乙醇提取物呈濃度依賴性地促進RKO細胞的凋亡。

細胞凋亡受多條信號通路調控，眾多關鍵蛋白在凋亡中發揮重要作用；其中Bcl-2基因被稱為“存活基因”，其基因產物Bcl-2蛋白具有抑制細胞丟失、阻止細胞凋亡的作用[10]；Bcl-2基因激活與大腸癌分化、轉移有關，可作為大腸癌預后的指標之一[11]。激活的Caspase-3蛋白是細胞凋亡的執行者，具有剪切管家蛋白和DNA片段的功能，是參與凋亡途徑的關鍵效應分子。本研究發現佩蘭乙醇提取物可以使RKO細胞Bcl-2蛋白表達降低，而活化的Caspase-3蛋白表達增加；佩蘭乙醇提取物可能通過抑制了Bcl-2蛋白的表達、促進活化的Caspase-3蛋白的表達而達到促細胞凋亡作用。

綜上所述，佩蘭乙醇提取物可以抑制RKO細胞生長，通過抑制Bcl-2蛋白的表達和促進caspase-3蛋白的活化而促使RKO細胞發生凋亡；具體何種成分發揮了該功效需要進一步通過天然藥物化學的分離技術輔以活性追蹤的手段捕捉活性單體化合物。