基于受激輻射信號的譜域光學相干層析分子成像方法?

胡喆皓 上官紫微 邱建榕 楊珊珊 鮑文 沈毅 李鵬 丁志華

(浙江大學光電科學與工程學院,現代光學儀器國家重點實驗室,杭州 310027)(2017年7月28日收到;2018年5月24日收到修改稿)

1 引 言

光學相干層析成像(OCT)技術[1?3]作為一種非接觸、無損傷的光學成像手段,針對活體生物組織的成像,可實現微米量級的成像分辨率和1—3 mm的成像深度,目前已在眼科、皮膚科、心血管等多個領域得到應用[4?16].隨著醫療水平的不斷提高,人們越來越關注疾病的早期診斷與治療.傳統OCT技術成像對比源于組織折射率波動導致的后向散射光的差異,但不同生理病理狀態下組織復折射率實部的變化不大,因此,現行OCT技術在分子特異性識別能力上存在先天不足[17?21].鑒于特定分子及其分布與疾病發生發展的關聯性,如果將分子光譜技術與傳統OCT技術有機結合,拓展OCT的分子識別功能,將具有重要的科學意義與應用價值,不僅能實現微米量級高分辨率結構成像,而且能獲取生理病理關聯分子的空間分布信息(關聯分子空間分布的分辨率仍在微米量級),這對于生物醫學光學成像技術而言,無疑是一個重要的飛躍.需要指出的是,拓展OCT的分子識別功能,并不意味著OCT系統的空間分辨率能達到分子尺度,而是指OCT成像信號與特定分子存在特異性關聯[22].

目前,基于熒光信號探測的熒光顯微成像是實現特異性分子成像的重要途徑.然而,熒光信號屬于非相干信號,無法滿足OCT成像對信號光的相干性要求,因而無法用于OCT成像.基于相干光的分子瞬態吸收或熱效應,采用雙光源和單光源外加倍頻的抽運探測方法,Desmond等[20]實現了黑色素的分子OCT成像,Kim和Applegate[21]實現了亞甲藍染料的分子OCT成像.Min等[23]首次將受激輻射信號用于分子成像,但主要目的是解決非熒光色團極其微弱的自發輻射熒光成像難題,并非用于OCT成像.不同于熒光信號,受激輻射信號是相干信號,可以在OCT中加以利用.

為此,本文提出基于受激輻射信號來拓展OCT的分子特異性,采用的分子特異性關聯信號是分子的受激輻射信號.選用傳統OCT中比較典型的超連續譜光源,通過增設光譜分光與調制抽運光支路,建立了基于單寬譜光源的抽運探測譜域OCT系統,發展了基于受激輻射信號的分子OCT成像方法.與以往報道過的采用兩個獨立光源分別負責抽運和探測、且兩個光源之間需要嚴格同步控制的抽運探測方案相比,本系統只需單一寬光譜光源,基于單一光源中的不同光譜段分別用于抽運和探測,不需要額外的同步裝置,因而具有明顯的成本和控制優勢.

2 方 法

圖1所示為基于受激輻射信號的譜域OCT系統示意圖,它在已建立的超高分辨率譜域OCT系統[11]基礎上,增設了調制抽運光支路.由超連續譜激光器(SC450,美國Fianium公司)發出的光,經擴束后通過截止濾光片(截止800 nm以上的光譜)分離出光譜范圍為450—800 nm的寬帶光譜光.該寬帶光譜光抵達二向色鏡后,分成反射和透射兩路光.反射光路為調制抽運光支路,其光譜范圍為480 nm±30 nm,該支路中設置了光學斬波器(optical chopper,美國Thorlabs公司),用于對抽運光的強度調制.透射支路為探測光支路,其光譜范圍為520—800 nm,該支路中設置了可調量程為10 cm的光學延遲線(對應的最大時間延遲約為300 ps).兩支路光經過第二個二向色鏡后匯合,并經分光鏡分為參考光和樣品光.抽運光與探測光同時抵達樣品,光脈沖間的時序圖如圖2所示.鑒于抽運光與探測光源于同一超連續譜激光器,抽運光與探測光的光脈沖間隔及光脈沖寬度均相同,分別為50 ns(對應于重復頻率20 MHz)和20 ps.抽運光脈沖與探測光脈沖的時域同步及相對時延,通過光學延遲線來控制,最大可調量程約為300 ps.從參考臂和樣品臂返回的光在分束鏡處匯合并發生干涉,通過另一截止濾光片(截止抽運光)后進入光譜儀.在光譜儀中,干涉光經衍射光柵分光,不同的光譜成分被透鏡聚焦到線陣CCD(中心波長為600 nm,1200 lines/mm,美國Thorlabs公司)分光,并由線陣CCD采集.

圖1 基于受激輻射信號的譜域OCT系統Fig.1.Schematic diagram of the stimulated-emission based spectral domain optical coherence tomography system.

圖2 抽運光脈沖和探測光脈沖間的同步示意圖Fig.2.Pulses synchronization between pump beam and probe beam.

圖3 調制抽運探測時序圖 (a)光學斬波器方波調制信號;(b)調制抽運光脈沖信號;(c)傳統探測光脈沖信號;(d)受激輻射探測光脈沖信號;(e)線陣CCD采樣信號Fig.3.Time sequence of the modulated pump-probe detection:(a)Squarewave modulation of the optical chopper;(b)modulated pulses of the pump beam;(c)unmodulated pulses of the input probe beam;(d)stimulated-emission pulses of the output probe beam;(e)sampling sequence of the CCD.

為實現受激輻射信號的高靈敏度提取,采用調制抽運探測方案,其時序如圖3所示.光學斬波器對抽運光脈沖序列進行了調制頻率為2.5 kHz的強度調制,該調制周期對應8000個探測光脈沖周期.受激輻射后的探測光脈沖幅度較之傳統的探測光脈沖呈現出微小增量.線陣CCD采樣頻率為25 kHz,是抽運光調制頻率的10倍,因此,對應于1個光學斬波器的調制周期,有10個CCD采樣周期.

如果暫不考慮受激輻射信號的貢獻,抵達CCD探測面的干涉信號可表示為

式中k=2π/λ代表波數,ρ表示CCD的響應度(單位A/W),S(k)為探測光的功率譜,rR為參考臂中反射鏡的反射系數,zR為以分光鏡為坐標原點的參考臂反射鏡距離,rS(z)為樣品中軸向分布的后向反射系數(與傳統OCT信號相對應),z為以分光鏡為坐標原點樣品中后向散射點的距離.不失一般性,將坐標原點設在參考反射鏡上,即zR=0,并假定rR=1,則(1)式簡化為

事實上,本系統中來自樣品的后向反射信號應該分為兩個部分.其一是對應于傳統散射對比機制的后向反射光,其二是對應于分子對比機制的受激輻射后向反射光.在抽運光的作用下,樣品中發色團被激勵到激發態后,在探測光的誘導下會產生與探測光傳播方向、相位及偏振態完全一致的受激輻射光,共同參與探測光的相干干涉.在非飽和條件下,受激輻射信號強度與抽運光光強、探測光幅值及發色團分子數成正比[24],即

式中Ipump,Iprobe,c(z)分別為抽運光的光強、探測光的光強、樣品中發色團分子數的軸向分布.因此,與上述兩部分返回光相對應的干涉光譜信號可分別寫為:

這里,η為受激輻射光子的產生效率m(t)為光學斬波器的調制信號,t代表時間.(4)式與(5)式分別代表了傳統OCT信號和受激輻射OCT信號.至此,線陣CCD采集到的干涉光譜信號可表示為

這里,mCCD(t)為線陣CCD的采樣函數,ID(k,t)為抵達CCD探測面的總干涉光譜信號.不失一般性,假定光學斬波器的調制信號和線陣CCD采樣函數均可由方波函數來表征,對應于光學斬波器調制頻率(ωm)一個調制周期Tm,調制信號和采樣函數分別表示為:

這里已根據系統條件,將線陣CCD采樣頻率10倍于光學斬波器調制頻率的因數考慮在內.

利用(7)式和(8)式,并對(6)式依次在k域做傅里葉逆變換,在t域做傅里葉變換,得到對應于干涉光譜采集信號的頻譜M(z,ω),表示為式中γ(z)為光源功率譜S(k)的傅里葉逆變換表征,OCT系統的軸向分辨率k1和k2為周期方波信號在t域上做傅里葉變換所得結果的級數,AC和AC′均表示自相關項,I=η·Ipump為受激輻射效率和抽運光強的乘積.(9)式所表示的頻譜中,處于調制頻率ωm處的信號對應于受激輻射信號,而在零頻處的信號可作為傳統OCT信號.為此,在調制頻率ωm處設置寬度為25 Hz的提取窗口并在頻率域沿窗口積分,可得受激輻射OCT的一個軸向分布(A-line)Ppp(z),其表達式為

類似傳統OCT的處理方法,對應于c(z)的信號可從(10)式中分離出來,即

由(11)式可知,受激輻射OCT信號與抽運光功率Ppump、樣品中發色團分子數軸向分布c(z)、樣品中后向反射系數rs(z)和探測光功率(包含在光源功率譜S(k)中)成正比.其中,抽運光功率Ppump和探測光功率在局部區域可近似為常數.因此,受激輻射OCT信號可以看作是反射系數rs(z)和發色團分子數c(z)的乘積.

同理,傳統OCT的軸向分布(A-line)也可從(9)式中得到,即

對比(11)式和(12)式可知,受激輻射OCT信號可以看作是反射系數rS(z)和發色團分子數c(z)的乘積;而在(12)式中傳統OCT的軸向分布與樣品的后向反射系數rS(z)成正比,無法反映發色團分子數c(z).這也說明了受激輻射OCT技術是針對特異性分子成像的一項技術,很好地彌補了OCT技術無法進行分子成像的缺陷.進一步,從(11)式和(12)式可知,利用受激輻射OCT信號和傳統OCT信號的比值,可以得到發色團分子數c(z).因此,采用(13)式來表征受激輻射OCT信號,即

3 實 驗

一般而言,生物組織的受激輻射OCT成像,可以基于內源性分子,也可基于外源性分子.這里,為了初步驗證受激輻射OCT成像技術的可行性,選取氮化物(Nitride)粉末作為受激輻射分子成像實驗樣品.該樣品的激發波長范圍為440—460 nm,自發輻射光譜范圍如圖4所示,其峰值波長為630 nm.因此,該樣品符合本系統所設計的抽運探測的光譜要求.

圖4 氮化物的自發輻射光譜Fig.4.Spontaneous emission spectrum of Nitride.

為驗證調制抽運探測方法的有效性,將氮化物粉末平鋪在厚度為2 mm的載玻片上,并利用上述系統進行掃描成像.不同于傳統OCT成像,為實現微弱受激輻射信號的探測,需在任意橫向位置處實施重復掃描.實驗中選擇的重復次數為500.由二維掃描振鏡的技術參數可得,本系統在水平方向的成像范圍為1.2 mm,完成樣品重復采樣所需的掃描時間約為4 min.典型結果如圖5所示.圖5(a)為傳統OCT圖像;圖5(b)為圖5(a)中紅色箭頭所指位置處的軸向分布信號,它由干涉光譜采集信號針對k域的傅里葉逆變換得到;圖5(c)為500次重復采樣過程中對應于圖5(b)中紅虛線深度位置的信號隨時間變化;針對圖5(c)的信號在時間域做傅里葉變換,可得對應于圖5(b)中紅虛線深度位置處的頻譜,如圖5(d)所示.從圖5(d)中可以發現,在抽運調制頻率(2.5 kHz)處有一尖峰,它由氮化物粉末的受激輻射信導致.

為驗證該信號確實對應于受激輻射信號,通過抽運光的開啟與關閉方式進行對照實驗,結果如圖6所示.圖6(a)和圖6(b)分別為抽運光開啟與關閉兩種條件下分光模塊的實驗照片.對應這兩種狀態,特定深度位置處的頻譜如圖6(c)和圖6(d)所示.不難發現,在調制頻率(2.5 kHz)處,紅箭頭所指的信號在圖6(c)中出現,而在圖6(d)中已消失.因此,圖6(c)中2.5 kHz處的信號確為受激輻射信號.

需要指出:表面上看,相比于背景噪聲,該信號的強度并不是很大,但是此信號對于OCT技術而言并不弱.OCT只探測單次散射光,而濾掉絕大部分的多次散射光,由此來保證軸向分辨率,這是OCT探測方法本身決定的.但鑒于OCT采用相干探測方法,其探測靈敏度一般可達100 dB,明顯高于常規的強度探測技術,因此仍可探測從樣品深處返回的弱信號.

圖5 抽運探測信號的處理過程 (a)傳統OCT圖像;(b)圖(a)中紅色箭頭所指位置處的軸向分布信號;(c)圖(b)中紅虛線深度位置處信號隨時間的變化;(d)圖(b)中紅虛線深度位置處的頻譜Fig.5.Signal processing procedure of the pump-probe detection:(a)Traditional OCT image;(b)axial distribution at the position indicated by the red arrow in(a);(c)variation of the signal with time at the depth position indicated by the red dotted line in(b);(d)rrequency spectrum at the depth position indicated by the red dotted line in(b).

圖6 抽運光開啟與關閉兩種狀態下的實驗結果對比 (a),(c)抽運光開啟;(b),(d)抽運光關閉Fig.6.Comparison of experimental results between switched on and offof the pump beam:(a),(c)Switched on the pump beam;(b),(d)turn offthe pump beam.

圖7 氮化物粉末構建樣品成像 (a)傳統OCT圖像;(b)受激輻射OCT圖像Fig.7.Images of samples composed of nitride power:(a)Traditional OCT image;(b)stimulated-emission based OCT image.

圖8 氮化物粉末與瓊脂顆粒構建樣品成像 (a)傳統OCT圖像;(b)受激輻射OCT圖像Fig.8.Images of samples composed of nitride powder and agar particles:(a)Traditional OCT image;(b)stimulated-emission based OCT image.

為驗證受激輻射成像的可行性,選擇氮化物粉末與蓋玻片來構建樣品,并利用上述系統進行掃描成像,成像結果如圖7所示.圖7(a)為傳統OCT圖像;圖7(b)為受激輻射OCT圖像.圖7(a)與圖7(b)對應于氮化物直接放置在厚度為0.17 mm的蓋玻片表面,并使蓋玻片傾斜一定的角度,蓋玻片的左半部分氮化物粉末厚度較大,右半部分氮化物粉末厚度很小.從圖7(b)中可以看到,對應氮化物熒光粉末濃度分布較大的位置的受激輻射信號較強,如圖中藍色箭頭所指向的位置.圖8所示的成像對象由氮化物粉末、瓊脂顆粒及蓋玻片構成.圖8(a)為傳統OCT圖像,其中兩大顆粒對應的是瓊脂顆粒,兩瓊脂顆粒之間分布了氮化物粉末.從圖8(b)中可以看出,在氮化物粉末區域(如圖中紅色箭頭位置)有受激輻射信號,而對應于瓊脂顆粒區域(如圖中藍色虛線框內)則基本上可看成是背景信號.對比圖8(a)和圖8(b)可知,傳統OCT圖像對樣品中所有的分子都可進行成像,無論是可以誘導產生受激輻射效應的氮化物熒光粉末,還是不會產生受激輻射的瓊脂顆粒,都能在傳統OCT圖像上顯示出輪廓與分布信息;相比之下,受激輻射OCT圖像則可以特異性地反映出可誘導產生受激輻射效應的氮化物熒光粉末的位置信息,如圖8(b)中信號較強的位置,而不會反映不發生受激輻射效應的瓊脂顆粒的位置信息.因此,受激輻射OCT技術是針對特異性分子成像的一項技術,很好地彌補了傳統OCT技術無法進行分子成像的先天不足.

此外,相比于傳統的熒光顯微成像技術,我們的方法基于受激輻射,受激輻射光與激發光為同方向的相干光,因此,可以利用低數值孔徑物鏡收集其后向散射的受激輻射光,采用干涉探測方法來獲取.而傳統熒光為自發輻射光,輻射光方向為以發射體為出發點的任意方向,通常需要高數值孔徑的物鏡來高效收集,而且它是非相干光,只能采用強度探測,無法采用OCT方法來探測.這也是至今為止OCT難以實施分子識別成像的原因.因此,較之于熒光顯微成像技術,基于受激輻射的OCT技術在分子成像領域具有優勢.

從圖8中可以看出,相比于傳統的OCT的成像結果,基于受激輻射信號的圖像的信噪比較低.雖然傳統OCT圖像與受激輻射OCT圖像采用完全不同的對比機制,不能直接比較,但是,為進一步提高該技術的可應用性,增大分子OCT圖像的對比度也是亟待解決的重要課題.

4 結 論

本文提出并發展了基于受激輻射信號的分子OCT成像方法.在超高分辨率譜域OCT系統的基礎上,通過增設光譜分光與調制抽運光支路,建立了基于單寬譜光源的抽運探測譜域OCT系統,發展了調制抽運下受激輻射OCT信號與傳統OCT信號同步獲取的方法.選取氮化物粉末作為分子成像實驗樣品,通過抽運光開啟與關閉的對照實驗,驗證了該分子受激輻射信號相干探測的可行性.基于研制的抽運探測譜域OCT系統與成像方法,實現了氮化物粉末構建樣品的傳統OCT與分子OCT的同步成像.