NSCLC患者血清miR系列基因表達水平及與化療療效的相關性研究

陳群 石琴

[摘要] 目的 探討非小細胞肺癌（non-small lung cancer， NSCLC）患者血清miR （microRNA）系列基因表達水平及與化療療效的相關性。 方法 2011年3月～2016年9月選擇200例未經任何抗癌治療的NSCLC患者作為NSCLC組，100例健康志愿者作為健康組，分別收集血清樣本；25例晚期NSCLC患者化療前和化療后的血清樣本。采用qRT-PCR方法檢測NSCLC組和健康組中血清miR系列基因表達水平，判斷血清miR系列基因表達水平與預后的關系。 結果 NSCLC組的血清miR-19a、miR-19b-1、miR-20a、miR-17-3p、miR-18a和miR-92-1基因表達與健康組存在差異（P<0.01）。NSCLC患者的血清上述基因表達化療前與化療后存在明顯差異（P<0.05）；健康組的血清miR-19a、miR-19b-1、miR-20a、miR-17-3p、miR-18a和miR-92-1基因表達與化療前患者存在明顯差異（P<0.05），與化療后的患者比較，差異無統計學意義（P>0.05）。 結論 NSCLC患者血清存在高水平miR系列基因表達，化療可降低miR系列基因表達水平，上述6種miR基因血清表達有助于NSCLC的診斷、預測和預后的判斷，聯合檢測有助于敏感性的提高。

[關鍵詞] 非小細胞肺癌；miR系列基因；預測；預后

[中圖分類號] R737.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）15-0018-04

Study on the correlation between the expression level of serum miR gene and chemotherapy efficacy in NSCLC patients

CHEN Qun SHI Qin

Department of Oncology， Fuzhou Pulmonary Hospital of Fujian， Clinical Teaching Hospital of Fujian Medical University， Fuzhou 350008， China

[Abstract] Objective To investigate the correlation between the expression levels of serum miR（microRNA） gene and chemotherapy efficacy in the patients with non-small cell lung cancer（NSCLC）. Methods From March 2011 to September 2016， 200 NSCLC patients without any anticancer treatment were selected as the NSCLC group. 100 healthy volunteers were selected as the healthy group. Serum samples were collected separately； serum samples before and after chemotherapy in 25 patients with advanced NSCLC were collected. The qRT-PCR method was used to detect the expression level of serum miR gene in NSCLC group and healthy group， and the relationship between the expression level of serum miR gene and prognosis was determined. Results The serum levels of miR-19a， miR-19b-1， miR-20a， miR-17-3p， miR-18a， and miR-92-1 in the NSCLC group were different from those in the healthy group（P<0.01）. There were significant differences in the expressions of the above genes before and after chemotherapy in the serum of NSCLC patients（P<0.05）； the serum levels of miR-19a， miR-19b-1， miR-20a， miR-17-3p， miR-18a and miR-92-1 in the healthy group were significantly different from those before chemotherapy（P<0.05）. There was no statistical difference compared with the patients after chemotherapy（P>0.05）. Conclusion There is a high level of miR gene expression in the serum of NSCLC patients. Chemotherapy reduces miR gene expression levels. The above six miR gene serum expressions contribute to the diagnosis， prediction and prognosis of NSCLC. The joint detection helps increase sensitivity.

[Key words] Non-small cell lung cancer （NSCLC）； miR gene； Prediction； Prognosis

中國惡性腫瘤中發病率和病死率最高的是肺癌，而且非小細胞肺癌（NSCLC）占85%，常見臨床分期是ⅢB或Ⅳ期。化療依然是晚期NSCLC不可替代的手段，其治療目標是延長患者總生存期（OS）、提高生活質量（QOL）、降低疾病相關的并發癥。雖然，針對肺癌的化學預防和治療已經取得了一些進展，但肺癌治療效果依舊不佳，近年來的研究表明肺癌的發生與轉移是一個極其復雜的多基因調控的多階段、多步驟過程。因此，從基因表達調控方面研究肺癌發生發展的機制，了解肺癌治療預測的相關因素，能更精準預測化療療效，優化治療方案，提高肺癌患者的生活質量和遠期生存率已經十分必要。microRNA（miRNA）是一類具有在轉錄后水平調控基因表達功能的非編碼小分子miRNA，在細胞的生長、增殖、代謝、凋亡等方面都有著重要的作用。通過監測NSCLC患者血清miR系列基因化療前后的變化，從而確定化療效果。本研究涉及6個指標miR-19a、miR-19b-1、miR-20a、miR-17-3p、miR-18a和miR-92-1的血清檢測，主要是觀察比較NSCLC患者化療前后血清miRNA的表達水平的改變，分析該改變對化療療效的影響，為血清miRNA在NSCLC治療中的相關研究提供參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 病例收集 分別收集2011年3月～2016年9月間的225例經病理組織學或細胞檢查證實的NSCLC患者，其中，200例采集抗癌治療前的血清樣本，作為NSCLC組，男133例，女67例，中位年齡65歲；另外，25例為晚期NSCLC患者，給予至少2個周期以上的常規一線化療，分別采集化療前和化療2個療程后的血清樣本，作為治療組，男16例，女9例，中位年齡63歲。選取100例正常體檢且各項指標正常的健康體檢者的血清樣本，作為健康組，男63例，女37例，中位年齡59歲。三組對象在性別、年齡方面比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。按期整理臨床治療資料。

1.1.2 入選標準[1，2] 患者年齡18～75歲，男女不限；化療患者具有化療的指征，ECOG評分0～1分；生存時間≥3個月；具有可測量的病灶，胸片、普通CT或MRI掃描病灶≥20 mm，螺旋CT或PET-CT掃描病灶≥10 mm；機體上沒有未愈合的創傷；體檢符合要求，外周血象：WBC≥4.0×109/L，PLT≥80×109/L，Hb≥90 g/L。腎功能：Cr≤2.0×UNL（正常上限）。肝功能：BIL≤2.0×UNL，ALT/AST≤5.0×UNL。心電圖基本正常；依從性好，配合血清樣本采集。

1.1.3 排除標準[1，2] 不符合入選標準者；具有嚴重的心肺功能衰竭；腹瀉（水樣便）或麻痹性腸梗阻；無法進行療效評價者；未得到控制的糖尿病；急性感染；孕婦和哺乳期婦女；健康組曾患有惡性腫瘤，NSCLC患者合并第二原發惡性腫瘤。

1.1.4 剔除標準[1，2] 未按上述標準入組并完成有關檢查治療者；因故和無故明顯推遲給藥時間超過2周者。觀察期間合并使用其他抗腫瘤化療藥物者；化療患者觀察期間對靶病灶同時進行放療者，或兼做其他抗腫瘤方案者。

1.2 方法

1.2.1 RNA分離提取 按照試劑說明書，血清的total RNA 使用microRNAs Isolation Kit（Applied Biosystems，Forster City，CA，USA）抽提。total RNA溶于DEPC處理水中，-80℃保存。RNA濃度使用Nanodrop 2100（Nanodrop，Wilmington，DE）測量。

1.2.2 實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）分析 差異表達使用兩步方法的實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應分析。第一步cDNA的反轉錄，第二步是實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應。miRNA的反轉錄相關操作按照試劑盒One Step PrimeScript?；microRNA cDNA Synthesis Kit（Takara，Tokyo，Japan）操作說明進行，反轉錄的反應體系為[3，4]：2×microRNA Reaction Buffer Mix 10 μL，0.1%BSA 2 μL，microRNA Prims Script?；RT Enzyme Mix 2 μL，Total RNA 1 μL，RNase Free ddH2O 5 μL。反轉錄反應條件：37℃ 60 min，85℃變性5 s。microRNA的實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應遵照試劑盒SYBR?；Premix EX TaqTM Ⅱ（Takara，Tokyo，Japan）操作說明進行，實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應體系為SYBR?；Premix EX TaqTM Ⅱ 12.5 μL，PCR Forward Primer 1 μL，Uni-miR qPCR Primer 1 μL，模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應條件為95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火和延伸30 s，共進行40個循環。定量PCR使用ABI7900的Fast real time PCR system（Applied Biosystems，Carlsbad，CA）執行，每個樣本平行重復3次，采用U6 snRNA 做參考基因，2-△△Ct method 用于計算基因表達倍數變化。

1.3 統計學方法

數據分析使用SPSS21.0軟件（SPSS，Inc.，美國），所有數據均符合正態分布，計量資料以（x±s）表示，組間數據使用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC組與健康組血清miRNA基因表達比較

由表1可知未經抗癌治療的NSCLC患者的血清miR-19a、miR-19b-1、miR-20a、miR-17-3p、miR-18a和miR-92-1基因表達較健康組明顯上調，差異有統計學意義（P<0.01）。

2.2 化療前、后的血清miR系列基因表達比較

25例晚期NSCLC患者化療前和化療2個療程后的血清miR系列基因表達水平，見表2。NSCLC組化療2個療程后的患者的血清miR-19a、miR-19b-1、miR-20a、miR-17-3p、miR-18a和miR-92-1基因表達與化療前存在明顯差異（P<0.05）；健康組的血清miR-19a、miR-19b-1、miR-20a、miR-17-3p、miR-18a和miR-92-1基因表達與化療前患者存在明顯差異（P<0.05），與化療后的患者比較，差異無統計學意義（P>0.05）。

3 討論

肺癌是當今發病率和病死率最高的惡性腫瘤，化療是晚期NSCLC不可替代的常用治療手段，但缺乏可靠的療效預測和生存預后方法。miRNA是一類小的、不具有蛋白質編碼功能的RNA。miRNA在腫瘤生長、增殖、擴散、轉移、侵襲等方面起主要作用，Yan等研究[5]顯示，約50%的miRNAs基因位于腫瘤相關的基因組區域或脆性位點，而且不同類型的腫瘤中具有明顯不同的miRNAs表達譜[6]，某些關鍵miRNA表達水平的失衡可能是腫瘤發生和發展的重要因素。血清miRNA可作為多種人類疾病的標志物[7]，研究顯示[8-11]，循環血miRNA在食道癌、胃癌、胰腺癌、結直腸癌等多種惡性腫瘤的早期診斷、腫瘤分期和預后效果等方面具有重要的警示作用。

在NSCLC的研究中[12-15]，顯示miR系列中的部分基因包括NSCLC在內的多種腫瘤患者的血清中存在穩定的高表達，極少受外界環境及自身的生理狀態的影響，而且化療后明顯降低，可成為很好的評價化療的效果[16，17]。Yu等[18]對112例NSCLC患者進行檢測，通過Cox模型和風險評分發現了5個預測NSCLC治療效果的miRNA信號，檢測循環血中的miRNA不失為一種非侵襲性診斷和治療肺癌有價值的方法，還可以預測和檢測某些藥物的治療效果[19]。但是大部分學者只研究1個miRNA基因或2個，評價腫瘤治療的效果十分有限。另外，腫瘤的生物學指標的表達可能與臨床病理特征和預后間存在一定的關聯。因此，準確判定晚期肺癌的預后因素仍存在挑戰。除去單因素風險因子的考慮外，聯合的miRNA基因表達水平分析能否進一步提高肺癌預后的準確性？

本項目擬在前期研究基礎上，進一步深入研究miRNA基因簇成員（miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1）在NSCLC血清中的表達情況，分析血清表達水平與化療療效和生存期的相關性。在此基礎上，對于有意義的miRNA聯合為一個參考指標，比較NSCLC患者化療前后血清miRNA的表達水平的改變，探討其對肺癌預測和預后的影響。本研究將有助于進一步了解miRNA基因簇成員在NSCLC的作用，并作為其療效和生存等分子標志物的依據。結果顯示，miR-19a、miR-19b-1、miR-20a、miR-17-3p、miR-18a和miR-92-1在NSCLC患者血清中的表達水平明顯較健康人群上調，說明更多的血清miRNA有助于NSCLC的診斷，而且部分早期的NSCLC患者就有多項指標表達水平顯著高于健康人群，有必要進一步研究其在NSCLC早期診斷的價值。此外，化療明顯降低上述基因在晚期NSCLC患者血清中的表達水平，說明上述6種血清miR基因有助于晚期NSCLC患者化療的療效預測。另外，患者分期愈晚，上述6種血清miR基因呈現高表達的項次愈多；而高表達項次愈多，其生存期也愈短，說明6種血清miR基因有助于預后的判斷，聯合檢測也有助于提高敏感性和特異性。當然，血清miR基因能否作為NSCLC患者臨床診斷、預后、預測的指標，不僅僅是血清有否高表達，還需明確閾值以及聯合檢測的意義，尚需更多的研究來驗證。

[參考文獻]

[1] Chiller JH，Harrington D，Belani CP，et al. Comparison of four chemotherapy regimens for advanced non-small-cell lung cancer[J].N Engl J Med，2002，346（2）：92-98.

[2] De Marinis F，Bria E，Baas P，et al. Treatment of unfit patients with advanced non-small-cell lung cancer：Definition criteria according an expert panel[J]. Clin Lung Cancer，2015，16（6）：399-405.

[3] 丁莎莎，陳曉麗，陳子興，等.MicroRNA -106a 在非小細胞肺癌中的表達及意義[J]. 現代腫瘤醫學，2015，23（16）：2289-2291.

[4] 費玲，李堅，朱立歡，等.血漿miRNA-155 和miRNA-625用于非小細胞肺癌診斷的臨床評價[J].江蘇大學學報（醫學版），2015，25（3）：236-241.

[5] Yan H，Wu J，Liu W，et al. MicroRNA-20a overexpression inhibited proliferation and metastasis of pancreatic carcinoma cells[J]. Hum Gene Ther，2010，21（12）：1723-1734.

[6] Weiland M，Gao XH，Zhou L，et al. Small RNAs have a large impact：Circulating microRNA as biomarkers for human diseases[J]. RNA Biol，2012，9（6）：850-859.

[7] Li H，Bian C，Liao L，et al. miR-17-5p promotes human breast cancer cell migration and invasion through suppression of HBP1[J].Breast Cancer Res Treat，2011，126（3）：565-575.

[8] 喬哲，李少民，張濰，等.非小細胞肺癌血清miR-191的表達及意義[J].現代腫瘤醫學， 2016，24（6）：910-912.

[9] Liu R，Chen X，Du YI，et al. Serum microRNA expression profile as a biomarker in the diagnosis and prognosis of pancreatic cancer[J].Clin Chem，2012，58（3）：610-618.

[10] Nugent M，Miller N，Kerin MJ. Circulating miR-34a levels are reduced in colorectal cancer[J].J Surg Oncol，2012， 106（8）：947-952.

[11] Schetter AJ，Okayama H，Harris CC. The role of microRNA in colorectal cancer[J]. Cancer J，2012，18（3）：244-252.

[12] Huang G，Nishimoto K，Zhou Z，et al. miR-20a encoded by the miR-17-92 cluster increases the metastatic potential of osteosarcoma cells by regulating Fas expression[J].Cancer Res，2012，72（4）：908-916.

[13] 張濰，王輝，喬哲，等. miR-19a和miR-19b在非小細胞肺癌中的表達[J]. 西安交通大學學報（醫學版），2015， 36（6）：810-815.

[14] Brase JC，Johannes M，Schlomm T，et al. Circulating miRNAs are correlated with tumor progression in prostate cancer[J]. Journal International du Cancer，2011， 128（3）：608-616.

[15] Zen K，Zhang CY. Circulating MicroRNAs：A novel class of biomarkers to diagnose and monitor human cancers[J]. Medicinal Research Reviews，2012，32（2）：326-348.

[16] 譚曉剛，支修益. MicroRNA與非小細胞肺癌[J].首都醫科大學學報，2015，36（4）：519-524.

[17] 欒嵐，韓斌，白陽，等.非小細胞肺癌組織miR-10b表達臨床意義分析[J].中華腫瘤防治雜志，2014，21（18）：1419-1422.

[18] Yu SL，Chen HY，Chang GC，et al.MicreRNA signature predicts survival and relapse in lung cancer[J].Cancer Cell，2008，13（1）：48-57.

[19] Gao W，Liu L，Lu X，et al.Circulating microRNAs：Possible prediction biomarkers for personalized therapy of non-small-cell lung carcinoma[J].Clin Lung Cancer，2011，12（1）：14-17.

（收稿日期：2018-01-09）