耐多藥肺結核患者基線菌株二線抗結核藥物耐藥情況分析

何貴清 施伎蟬 吳聯朋 蔣賢高

[摘要] 目的 了解耐多藥肺結核患者基線菌株對二線抗結核藥物的耐藥情況。 方法 隨機選取從2016年3月～2017年5間本院收集的耐多藥肺結核患者的基線52株，對其進行9種二線抗結核藥物的敏感性進行試驗，分析對不同藥物耐藥比例以及同類藥物交叉耐藥情況。 結果 9種二線抗結核藥物中，耐藥比例順位依次為氧氟沙星=左氧氟沙星（均占59.6%，31/52）>莫西沙星（占30.8%，16/52）>阿米卡星=卡那霉素（均占9.6%，5/52）>對氨基水楊酸=環絲氨酸（均占7.7%，4/52）>卷曲霉素=丙硫異煙胺（均占5.8%，3/52）。氧氟沙星和左氧氟沙星呈完全交叉耐藥，與莫西沙星交叉耐藥比例占51.6%（15/31）；阿米卡星和卡那霉素呈完全交叉耐藥，與卷曲霉素交叉耐藥占60%。 結論 耐多藥肺結核患者基線菌株對氟喹諾酮類藥物耐藥嚴重，其他二線抗結核藥物亦存在不同程度耐藥。因此，在制定起始有效耐多藥結核治療方案前應完善二線藥物敏感性試驗。

[關鍵詞] 分枝桿菌；結核；二線藥物；藥物敏感性試驗；耐多藥結核

[中圖分類號] R521 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2018）15-0084-04

Analysis of drug resistance of second-line anti-TB drugs to baseline strain in patients with multidrug-resistant pulmonary tuberculosis

HE Guiqing1 SHI Jichan1 WU Lianpeng2 JIANG Xiangao1

1.Department of Infectious Diseases，Wenzhou City Central Hospital in Zhejiang Province，Wenzhou 325000，China； 2.Department of Laboratory，Wenzhou City Central Hospital in Zhejiang Province，Wenzhou 325000，China

[Abstract] Objective To investigate the resistance of second-line anti-TB drugs to baseline strain in patients with multidrug-resistant pulmonary tuberculosis. Methods A total of 52 baseline strains in patients with multidrug-resistant pulmonary tuberculosis collected from March 2016 to May 2017 in our hospital were randomly selected. The sensitivity of the nine kinds of second-line anti-TB drugs was tested， to analyze the proportion of different drug resistance and cross-resistance of similar drugs. Results Among the 9 second-line anti-TB drugs， the ratio of drug resistance was ofloxacin=levofloxacin（59.6%， 31/52）>moxifloxacin（30.8%， 16/52）> amikacin=kanamycin（both 9.6%， 5/52）>p-aminosalicylic acid=cycloserine（both 7.7%， 4/52）> capreomycin =prothionamide（both 9.6%，3/52）. Ofloxacin was completely cross-resistant with levofloxacin， and its cross-resistant rate with moxifloxacin accounted for 51.6%（15/31）. Amikacin was completely cross-resistant with kanamycin， and its cross-resistant rate with capreomycin accounted for 60%. Conclusion The baseline strains of patients with multi-drug resistant pulmonary tuberculosis are seriously resistant to fluoroquinolones. There is resistance to some extent for other second-line anti-tuberculosis drugs. Therefore， second-line drug susceptibility testing should be completed prior to establishing an effective MDR-TB treatment regimen.

[Key words] Mycobacterium； Tuberculosis； Second-line drugs； Drug susceptibility testing； Multidrug-resistant tuberculosis

全球耐多藥結核病形式嚴峻，療程長，需聯合4～5種藥物，不良反應大，傳統WHO推薦長療程方案至少大于20個月，導致患者難以堅持，在真實世界里，治療成功率不足50%，提示縮短療程勢在必行。值得可喜的是孟加拉等國短程治療方案治療成功率顯著高于傳統長療程方案[1-3]，促使2016 WHO制定了耐多藥結核病短程方案并向全世界推廣[4]，但由于是非隨機對照研究，詢證學依據尚不充分。特別國內耐多藥結核病基線菌株的Pre-XDR和XDR-TB比例較高[5-6]，當前盲目推廣短程方案未必可行，可能因治療不充分勢必造成更多藥物耐藥，需及時完善二線抗結核藥物敏感性試驗制定合理方案。國內耐多藥結核病二線耐藥情況因地區不同而異。因此，本研究隨機抽取溫州市中心醫院2016年3月～2017年5月期間保種的耐多藥肺結核患者基線菌株52株，對其進行9種二線抗結核藥物敏感性試驗并分析，以了解我院收治耐多藥肺結核基線菌株9種二線抗結核藥物的耐藥情況，為制定有效的起始抗耐多藥結核方案提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 菌株來源

菌株來源溫州市中心醫院收集的MDRTB肺結核患者的基線菌株，隨機抽取2016年3月～2017年5月期間保種的基線菌株52株經羅氏培養基復蘇傳代。標準株H37Rv菌株來自浙江省結核病參比實驗室。1.2 主要試劑

羅氏培養基及分枝桿菌藥敏羅氏培養管均購自珠海貝索生物技術有限公司。

1.3 羅氏比例法藥敏試驗

羅氏比例法藥敏試驗具體操作參考文獻[7]進行。羅氏比例法藥敏試驗的9種二線抗結核藥物，具體濃度如下：氧氟沙星（Ofx）：2.0 μg/mL；左氧氟沙星（Lfx）：2.0 μg/mL；莫西沙星（Mfx）：2.0 μg/mL；阿米卡星（Ak）：30.0 μg/mL；卡那霉素（Km）：30.0 μg/mL；卷曲霉素（Cm）：40.0 μg/mL；丙硫異煙胺（Pto）：40 μg/mL；環絲氨酸（Cs）：40.0 μg/mL；對氨基水楊酸（PAS）：1.0 μg/mL。每批藥敏試驗以標準株H37Rv作為敏感對照組。受試菌株的藥物敏感性結果判斷標準如下：

耐藥百分比=含藥培養基菌落數/對照培養基上菌落數×100%；如果耐藥百分比< 1%者報告敏感（S）；如果耐藥百分比≥1%者報告耐藥（R）。

2 結果

2.1 9種二線抗結核藥物耐藥情況

在52株耐多藥結核分枝桿菌菌株中，對9種抗結核藥物全敏感有19株（占36.5%），任一耐藥的抗結核藥物順位依次為Ofx=Lfx（均占59.6%，31/52）>Mfx（占30.8%，16/52）>AK=Km（均占9.6%，5/52）>PAS=Cs（均占7.7%，4/52）>Cm=Pto（均占5.8%，3/52）。見表1。

2.2 二線抗結核藥物交叉耐藥情況

Ofx和Lfx完全交叉耐藥，耐藥Ofx/Lfx 31株中，有16株同時耐Mfx（即Ofx/Lfx與Mfx交叉耐藥占51.6%）。Ak和Km完全交叉耐藥，耐Ak/Km 5株中，有3株同時耐Mfx（即Ak/Km與Cm交叉耐藥占60.0%）。見表2。

3 討論

目前WHO推薦的MDR-TB標準化方案能夠治愈相對部分患者，如起始組成方案包含無效藥物可能會降低治愈率[7-8]，不僅使患者遭受不必要的藥物毒副作用，而且增加耐藥性[9]。研究報道，MDR-TB方案中兩類核心藥物，如氟喹諾酮類藥物耐藥后，治療成功率降低[10-11]，而二線針劑類藥物耐藥與預后亦有相關性[12]。唯一有效預防因起始治療無效或不充分的方法就是及時檢測二線抗結核藥物的敏感性，以制定個體化治療方案。因此，本次研究隨機選取52株耐多藥肺結核患者的基線菌株檢測9種二線藥物敏感性試驗，了解本院MDR-TB基線菌株的二線抗結核藥物的耐藥性。本院是溫州市耐多藥結核病定點醫院，收治全市的耐多藥結核病患者，但本次研究并未全部納入2016年3月～2017年5月全部基線菌株進行檢測分析，而且樣本量較小，存在一定抽樣偏倚，雖不能代表本地區的耐藥流行情況，但在某種程度上本研究結果表明，耐多藥肺結核患者基線菌株對二線抗結核藥物存在的不同程度耐藥需引起臨床醫生、尤其是肺科醫生的重視。

本研究發現耐氟喹諾酮類藥物較嚴重，與上海某醫院報道的耐多藥結核菌株對氟喹諾酮類藥物耐藥較接近[6]，特別是Ofx和Lfx耐藥比例較高，而且與Mfx超過1/2呈交叉耐藥，氟喹諾酮耐藥情況可能與院外該類藥物不合理使用有關[13-14]。浙江省流調發現2013年MDR-TB菌株耐Ofx達27.7%[15]。因此，對于耐多藥肺結核患者，在沒有二線藥敏結果情況下，選擇喹諾酮類藥物應慎重，尤其盡量避免使用低代氟喹諾酮類藥物，如氧氟沙星和左氧氟沙星。而對于低代氟喹諾酮類藥物耐藥的患者，選擇Mfx能改善Mfx敏感株的耐多藥結核病患者的預后[16]。WHO指出，氟喹諾酮類為耐多藥結核方案的核心藥物，列為A組用藥，能顯著改善單利福平耐藥結核及耐多藥結核患者的療效，如無禁忌證，必須納入治療方案[4]。對氟喹諾酮類藥物的耐藥是MDR-TB向XDR-TB進展的耐藥主要形式。因此，耐多藥肺結核患者起始治療不充分可能會導致最終治療失敗，誘發更多藥物耐藥，如XDR-TB或全耐藥，增加傳播耐藥的高風險。二線注射類藥物（Ak， Km和Cm）是耐多藥結核病化療方案中同樣起著舉足輕重的作用，WHO列為B組用藥，可增加耐多藥結核患者治療的成功率，因此，無禁忌證，同樣必須納入方案[4]。本研究發現，二線注射類藥物耐藥比例相對較低，浙江省2013年二線針劑耐藥比例為8.5%，與其報道相接近[15]，提示耐多藥結核對二線針劑藥物敏感性可能較好，尤其Cm耐藥比例更低，在Ak/Km耐藥后，部分患者可繼續選擇Cm仍然有效。本次研究中的其他二線口服抗結核藥物如PAS、Cs和Pto耐藥比例相對較低，趙冰等[5]從全國2007～2008年耐藥基線調查收集的菌株中選取2008年4～7月期間的126株MDR-TB菌株進行二線藥敏試驗發現PAS和Pto耐藥比例均為3.2%，而Cs為13.5%；而浙江省流調結果顯示2013年MDR-TB菌株的PAS 和Cs耐藥比例分別為14.9%和10.6%[5，15]。故制定起始治療方案時二線藥物敏感試驗尤為重要。

目前絕大多數有資格開展一線抗結核藥敏試驗的結核病實驗室，二線抗結核藥物敏感試驗并非常規開展，而是等待一線藥敏結果回報利福平和異煙肼耐藥后再繼續檢測二線藥敏，而部分患者因失訪而未繼續檢測二線藥敏。因此，相當部分患者在等待二線藥敏結果期間很有可能因起始方案無效導致耐藥傳播，或因治療方案不充分發生進一步獲得耐藥而增加耐藥傳播[17]。表型藥敏雖然準確，但需要等待較久時間[18]，無法早期制定起始有效治療方案。因此2016年WHO推薦快速二線分子藥敏線性探針GenoType MTBDRsl以指導個體化治療[19]。高謙教授團隊對治療過程中的患者體內結核菌的耐藥微進化進行了深入研究發現，“有效”治療組和“非有效”治療組多藥聯用下患者體內結核菌發生截然相反的耐藥微進化動態變化：即前者阻止了耐藥性獲得；而后者則發生耐藥突變的積累與富集[20]。該項研究結果提示迫切需要及時、準確的藥敏結果以制定起始有效的治療方案，對于提高治愈率、減少耐藥產生具有十分重要的意義。

總之，通過本次研究，發現耐多藥肺結核基線菌株對氟喹諾酮類藥物高度耐藥，盡管Mfx耐藥比例低于Ofx和Lfx，但仍存在較高交叉耐藥性，尤其缺乏二線抗結核藥物敏感性檢測結果時，起始選擇氟喹諾酮類藥物需謹慎。本研究發現耐多藥結核菌株對二線針劑類敏感性相對較好，可優先選擇。其他二線口服抗結核藥物亦存在不同程度耐藥。因此，耐多藥結核病患者在起始組成有效方案時，應完善二線抗結核藥物敏感性試驗，特別是快速二線分子藥敏檢測開展，可縮短檢測等待時間，達到精準快速有效治療，提高治愈率，減少耐藥發生及其耐藥的傳播。

[參考文獻]

[1] Aung J，Van Deun A，Declercq E，et al. Successful 9-month Bangladesh regimen' for multidrug-resistant tuberculosis among over 500 consecutive patients[J]. Int J Tuberc Lung Dis，2014，18（10）：1180-1187.

[2] Kuaban C，Noeske J，Rieder HL，et al. High effectiveness of a 12-month regimen for MDR-TB patients in Cameroon[J].Int J Tuberc Lung Dis，2015，19（5）：517-524.

[3] WHO. Global Tuberculosis Report 2017[Internet]. Geneva：World Health Organization，http：//www.who.int/tb/publications/global report/en，2017-11-12.

[4] WHO. WHO Treatment guidelines for drug-resistant tuberculosis，2016 Update[Internet]. Geneva：World Health Organization，http：//www.who.int/tb/areas-of-work/drug-resistant-tb/treatment/resources/en，2017-11-12.

[5] 趙冰，宋媛媛，逄宇，等.中國耐多藥結核分枝桿菌二線抗結核藥物敏感性分析[J]. 中國防癆雜志，2013，35（10）：831-834.

[6] 劉一典，桂徐蔚，景玲杰，等. 耐多藥結核分枝桿菌臨床分離株30株對氟喹諾酮類及二線注射類抗結核藥敏感性的分析[J]. 中華臨床醫師雜志（電子版），2013， 4（7）：1565-1568.

[7] 趙雁林，逢寧. 結核病實驗室檢驗規程[M]. 北京：人民衛生出版社，2015：59-65.

[8] Falzon D，Gandhi N，Migliori GB，et al. Resistance to fluoroquinolones and second-line injectable drugs：Impact on multidrug-resistant TB outcomes[J]. Eur Respir J，2013，42：156-168.

[9] Cegielski JP，Kurbatova E，van der Walt M，et al. Multidrug-resistant tuberculosis treatment outcomes in relation to treatment and initial versus acquired second line drug resistance[J]. Clin Infect Dis，2016，62：418-430.

[10] Alene KA，Yi H，Viney K，et al. Treatment outcomes of patients with multidrug-resistant and extensively drug resistant tuberculosis in Hunan province，China[J]. BMC Infect Dis，2017，17（1）：573.

[11] Farhat MR，Jacobson KR，Franke MF，et al. Fluoroquinolone resistance mutation detection is equivalent to culture-based drug sensitivity testing for predicting multidrug-resistant tuberculosis treatment outcome：A retrospective cohort study[J]. Clin Infect Dis，2017，65（8）：1364-1370.

[12] Oliveira O，Gaio R，Villar M，et al. Predictors of treatment outcome in multidrug-resistant tuberculosis in Portugal[J]. Eur Respir J，2013，42（6）：1747-1749.

[13] Dooley KE，Golub J，Goes FS，et al. Empiric treatment of community-acquired pneumonia with ？覲uoroquinolones，and delays in the treatment of tuberculosis[J]. Clinical Infectious Diseases，2002，34（12）：1607-1612.

[14] Devasia RA，Blackman A，Gebretsadik T，et al. Fluoroquinolone resistance in Mycobacterium tuberculosis：The effect of duration and timing of ？覲uoroquinolone exposure[J].American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine，2009，180（4）：365-370.

[15] Wu B，Zhang L，Liu Z，et al. Drug-resistant tuberculosis in Zhejiang Province，China：An updated analysis of time trends，1999-2013[J]. Glob Health Action，2017，10（1）：1293925.

[16] Chien JY，Chien ST，Chiu WY，et al. Moxifloxacin improves treatment outcomes in patients with ofloxacin-resistant multidrug-resistant tuberculosis[J]. Antimicrob Agents Chemother，2016，60 （8）：4708-4716.

[17] Kempker RR，Kipiani M，Mirtskhulava V，et al. Acquired drug resistance in mycobacterium tuberculosis and poor outcomes among patients with multidrug resistant tuberculosis[J]. Emerg Infect Dis，2015， 21（1）：992-1001.

[18] Domínguez J，Boettger EC，Cirillo D，et al. Clinical implications of molecular drug resistance testing for Mycobacterium tuberculosis：A TBNET/RESIST-TB consensus statement[J]. Int J Tuberc Lung Dis，2016，20（1）：24-42.

[19] WHO. The use of molecular line probe assays for the detection of resistance to second-line anti-tuberculosis drugs：Policy Guidance[Internet]. http：//www.who.int/tb/publications/lpa-mdr-diagnostics/en， 2017-11-21.

[20] Trauner A，Liu Q，Via LE，et al. The within-host population dynamics of Mycobacterium tuberculosis vary with treatment efficacy[J]. Genome Biol，2017，18（1）：71.

（收稿日期：2018-01-27）