潰結寧膏穴位敷貼對潰瘍性結腸炎（脾腎陽虛證）大鼠Th17/Treg平衡的影響*

王燚霈 朱 瑩△ 高 昂

（1.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙 410005；2.湖南省長沙市望城區人民醫院，湖南 長沙 410200）

潰瘍性結腸炎（UC）是一種以結腸黏膜及黏膜下層連續彌漫的潰瘍及糜爛為特點的慢性非特異性炎癥性腸病，病情易反復，難以治愈，病變持續時間較長，有一定的癌變率［1］，是目前世界公認的難治性疾病。腸道免疫功能紊亂是UC的重要病因。目前研究證明Th17/Treg平衡是腸道免疫功能動態平衡的重要組成部分，其失衡是UC的發病的關鍵要素［2］。潰結寧膏是本課題組負責人總結治療UC（脾腎陽虛證）經驗而創制的，療效確切［3-5］。為明確其治療UC的作用機制，筆者選取UC（脾腎陽虛證）大鼠為觀察對象，研究潰結寧膏穴位敷貼對Th17/Treg平衡的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠40只，體質量（200±20）g，由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供。動物合格證號：SCXK（湘）2011-0003，SPF實驗室許可證編號：SYCK（湘）2013-0005。標準飼料喂養，自由飲用三級過濾純凈水，飼養環境為多層層流架，恒溫20～26℃，濕度控制在40%～70%，12 h光照/12 h黑暗，適應性喂養1周后開始實驗。

1.2 試藥與儀器 1）試藥：潰結寧膏由炮附片、細辛、丁香、芥子、赤芍、延胡索、生姜等組成，由湖南中醫藥大學第二附屬醫院藥劑科提供并制成巴布劑；番瀉葉，本院藥劑科提供；無藥物巴布劑基質由聚丙烯酸鈉、明膠、高嶺土、甘羥鋁、蓖麻油、甘油、聚乙烯醇制成，本院藥劑科提供；柳氮磺胺吡啶片，0.25 g/片，上海三維制藥有限公司，批號：20120615。 2）試劑及儀器：2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS），美國 Sigma 公司，批號：107K5008；腺嘌呤（Adenine）（購自上海博景化工有限公司），加蒸餾水配置為20g/L混懸液；Foxp3 ELISA試劑盒、IL-17 ELISA試劑盒，武漢基因美生物科技有限公司；臺式冷凍離心機，湘儀 TGL-16；全自動酶標洗板機，匯松PW-812；酶標儀，匯松MB-530；電熱恒溫干燥箱，光都DHG-900Z-0；電子天平，江蘇省武進市衡器廠RTZ-IOA-RT；S2-93自動雙重純水蒸餾器，上海亞榮生化儀器廠；AO切片機，LEICA公司RM2235；光學顯微鏡，OLYMPUS公司BX50。

1.3 分組與造模 健康的SPF級SD雄鼠40只被毛染色法編號、稱體質量，按照隨機數字表法將40只大鼠分為正常對照組、潰瘍性結腸炎（脾腎陽虛證）模型組（模型組）、潰結寧膏穴位敷貼治療組（敷貼組）、柳氮磺吡啶治療組（SASP組），每組均為10只。模型組、敷貼組及SASP組大鼠進行動物模型制備。UC（脾腎陽虛證）大鼠模型建立方法參考課題組前期研究［6］。每天上午定時定點，大鼠予腺嘌呤按10 mL/kg劑量灌胃，連續2周，從第3周起開始每日予冰番瀉葉按10 mL/kg灌胃，連續2周，造模周期共4周，造模期間自由飲食；每日灌胃0.5 h后用噴霧器給每只大鼠均勻噴4℃冰水50 mL，濕潤皮毛，然后將大鼠置于電風扇前（1400 r/min）吹干處置，連續4周后于第29天禁食不禁水24 h，用10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉后，將聚丙烯管插入大鼠肛門上段8 cm處，注入5%TNBS按100 mg/kg（約TNBS原液0.2 mL/100 g）加50%乙醇0.25 mL制成的混合試劑，然后提起大鼠尾部，保持倒置1～2 min，使試劑充分完全在大鼠腸腔滲透，然后將大鼠輕放置于籠子，待其自然清醒，自由飲食飲水。正常對照組大鼠則同期予相應劑量的0.9%氯化鈉注射液灌胃和灌腸處理。

1.4 干預方法 所有大鼠均選取以下穴位：中脘、氣海、足三里（雙側）、天樞（雙側）。各穴定位參考郭義主編《實驗針灸學實驗指導》［7］及《大鼠穴位圖譜的研制》［8］。中脘：臍上約20 mm左右。氣海：臍下約12 mm左右。足三里：在膝關節下側，腓骨小頭下緣5 mm處，左右兩側各一穴。天樞：在臍旁0.5 cm，左右兩側各一穴。敷貼位置先用剪刀將毛剪短，再用剃毛器將毛剃凈，每次剃毛4 cm2大小，貼藥至穴位處后予鼠夾固定。1）正常對照組：將無藥物的巴布劑基質穴位敷貼，0.9%氯化鈉注射液［5 mL/（kg·d）］灌胃。 2）模型組：處理同正常對照組。3）敷貼組：潰結寧膏穴位敷貼，0.9%氯化鈉注射液［5 mL/（kg·d）］灌胃。 4）SASP 組：無藥物的巴布劑基質穴位敷貼，柳氮磺胺吡啶溶液（用0.9%氯化鈉注射液配成10 mg/mL的溶液）50 mg/kg劑量灌胃。各組于造模結束后1周開始給藥，每日1次，敷貼時間每次1～1.5 h。足三里、天樞每次貼一側，左右交替，給藥療程均為28 d。

1.5 標本采集與檢測 1）一般情況觀察。實驗期間每天檢測并記錄各組大鼠體質量、飲食飲水量及肛溫作量化指標，觀察各組大鼠大便性狀、大便次數和血便程度及背毛光澤程度、活動度、精神狀態及活動等一般狀況。2）疾病活動指數（DAI）評分。實驗期間觀察大鼠體質量、大便性狀、血便情況，按DAI評分標準［9］進行評分，即DAI=（體質量下降指數+大便性狀+出血情況）÷3。3）結腸黏膜損傷指數（CMDI）。治療28 d后大鼠禁食12 h，以10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射麻醉，剪開腹壁，快速取結腸組織，肉眼觀察結腸病變組織腸黏膜形態，以正常、糜爛、潰瘍分級描述，進行結腸黏膜大體形態損傷指數評分［10］。4）結腸組織病理學及組織學損傷指數（TDI）。大鼠脊椎脫臼法處死后，取約1 cm結腸腸段用4%多聚甲醛固定，組織脫水，石蠟包埋，切片機切片，進行常規HE染色，使用光學顯微鏡觀察結腸組織病理變化，進行結腸組織學損傷評分［11］。5）血清及結腸中IL-17、Foxp3水平的測定。取1段長約0.5 cm的結腸組織，冰生理鹽水清洗，置于EP管中，采用ELISA法進行測定，嚴格按照試劑盒說明進行操作。

1.6 統計學處理 應用SPSS21.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，各組數據先進行正態性分布及方差齊性檢驗，符合者，組間比較采用單因素方差分析，不符合者采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組一般情況觀察 正常對照組大鼠在整個實驗過程中未出現明顯的變化，大小便、活動度、精神、飲食飲水量均正常。造模過程中模型組、敷貼組及SASP組大鼠逐漸出現大便溏泄，體毛逐漸枯槁失去光澤，喜扎堆，活動度減少，精神欠佳，頻繁瞇眼，飲食及飲水量逐漸減少，與正常對照組比較體質量增長緩慢，小便次數增多；造模結束后上述3組大鼠解黏液便，大便隱血陽性，肛門周圍沾有污物，拱背蜷縮，喜集聚，體毛枯槁稀疏，精神萎頓，小便清長，飲食及飲水量明顯降低，體質量增長幅度較正常組大鼠明顯減小，部分甚至出現腹部脹滿。經過28 d治療后SASP組、敷貼組大鼠黏液膿血便、神態萎頓、嗜睡懶動，拱背蜷縮聚堆等癥狀基本消失，飲食及飲水接近正常對照組，動作較前靈敏，精神好轉；模型組大鼠持續解黏液大便，偶可見鮮紅色血便，精神持續變差，少氣懶動，體毛枯槁脫落，小便量及次數多，飲食及飲水量進一步減少，體質量較前繼續下降。

2.2 各組大鼠體質量、飲水及肛溫量化比較 見表1。治療前，與正常對照組對比，模型組、敷貼組及SASP組各組大鼠體質量下降，飲水量明顯減少，肛溫降低，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），說明脾腎陽虛UC體質量下降，飲水量減少，肛溫降低。治療后，與正常對照組相比，模型組大鼠體質量下降，飲水量下降，肛溫降低，差異有統計學意義（P＜0.01），說明疾病持續進展，無明顯緩解；與模型組比較，敷貼組、SASP組大鼠體質量、飲水量增加，肛溫升高，差異有統計學意義（P＜0.05），提示敷貼、SASP 治療有效；SASP 組與敷貼組體質量、飲水量、肛溫相比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。正常對照組、模型組治療前后比較差異無統計學意義（P＞0.05）。敷貼組及SASP組治療后較治療前體質量、飲水量增加，肛溫升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠體質量、飲水量及肛溫比較（±s）

表1 各組大鼠體質量、飲水量及肛溫比較（±s）

與本組治療前比較，▼P＜0.05；與模型組治療后比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與敷貼組治療后比較，▽P＜0.05，▽▽P＜0.01

體質量（g） 飲水量（mL） 肛溫（℃）385.10±25.70▲▲▽▽ 202.50±21.70▲▲▽▽ 37.80±0.16▲▽396.70±26.20▲▲▽ 210.50±22.70▲▲▽ 37.80±0.18▲▲296.40±23.50 120.60±15.50 36.70±0.17（n＝9） 治療后 276.40±16.50▽ 111.60±14.30▽ 36.50±0.16▽敷貼組 治療前 300.30±21.50 115.40±16.30 36.80±0.20（n＝9） 治療后 365.30±22.50▲▼ 188.50±17.80▲▼ 37.60±0.20▲▼SASP 組 治療前 299.50±20.40 120.40±15.30 37.00±0.19（n＝9） 治療后 370.50±23.20▲▼ 190.80±16.10▲▼ 37.50±0.18▲▼組 別 時間正常對照組 治療前（n＝10） 治療后模型組 治療前

2.3 各組大鼠DAI、CMDI、TDI比較 見表2。與正常對照組相比，各組大鼠DAI、CMDI及TDI均增高，差異具有顯著統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組相比較，敷貼組及SASP組DAI、CMDI及TDI均顯著降低（P＜0.01），但敷貼組、SASP兩組間各積分比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠疾病活動指數、結腸黏膜損傷指數、結腸組織損傷評分比較（分，±s）

與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01。下同

組 別 n TDI DAI CMDI正常對照組 10 0.82±0.42模型組 9 5.84±1.48**敷貼組 9 2.12±1.06*▲▲0.09±0.18 0.72±0.37 3.00±0.37** 4.61±0.98**1.01±0.29*▲▲ 1.84±0.78*▲▲SASP 組 9 1.87±1.23*▲▲0.91±0.21*▲▲ 1.66±0.74*▲▲

2.4 各組大鼠結腸組織病理觀察 見圖1。正常對照組：上皮完整，各層結構清晰。模型組：黏膜缺損并且壞死脫落，可見潰瘍灶形成，嚴重者深達黏膜下層，伴中性粒細胞等大量炎性細胞浸潤。敷貼組：黏膜缺損較少，黏膜及黏膜下炎性細胞浸潤少，腺體結構改善。SASP組：黏膜下毛細血管充血，黏膜下層稍有水腫，少量炎性細胞浸潤。

2.5 各組大鼠血清及結腸組織中IL-17和血清中Foxp3水平比較 見表3。與正常對照組比較，模型組、敷貼組、SASP組大鼠血清及結腸中IL-17水平均明顯升高、血清Foxp3水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，敷貼組及SASP組大鼠血清及結腸組織中IL-17水平明顯降低、血清Foxp3水平明顯增高（P＜0.01），但敷貼組與SASP組表達差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 大鼠結腸組織病理觀察（HE染色，100倍）

表3 各組大鼠血清及結腸組織IL-17、血清Foxp3比較（pg/mL，±s）

表3 各組大鼠血清及結腸組織IL-17、血清Foxp3比較（pg/mL，±s）

組 別 n 血清Foxp3血清IL-17 結腸IL-17正常對照組 10 4650.41±14.00模型組 9 2706.35±6.68**敷貼組 9 3439.17±17.50*▲▲124.09±1.65 93.39±1.76 242.44±10.49**190.83±1.94**174.77±1.61*▲▲ 153.39±2.00*▲▲SASP 組 9 3464.68±12.47*▲▲170.35±4.39*▲▲ 149.00±1.87*▲▲

3 討 論

UC的發病機制復雜，涉及環境和遺傳因素。UC被認為是由于上皮屏障功能受損、腸道菌群失調和異常免疫反應的結果［12］。當前，國內外學者普遍認為腸道免疫在UC的發病中扮演了重要角色［13］。正常狀態下，腸黏膜免疫細胞自發分泌抗炎因子與促炎因子，并保持動態平衡，以維持腸道的正常免疫，當機體受到刺激時，該平衡被打破，炎性因子的分泌失衡，抗炎因子降低，促炎因子升高，導致腸黏膜免疫失衡［14］。Th17與Treg是一對具有相互拮抗作用的T淋巴細胞，維持著腸道免疫穩態平衡，當腸道出現異常時常表現出Th17/Treg失衡，引起一系列炎癥反應損傷腸道組織。Th17 細胞主要分泌 IL-17、IL-6、IL-21、IL-22、TNF-α等細胞因子，在UC中起促炎性作用［15］。Treg細胞主要以表達轉錄因子Foxp3為特征，它具有免疫抑制功能，能控制腸道炎癥。近年來有研究表明Th17/Treg平衡向Th17方向傾斜時UC發生發展，當Th17/Treg平衡像Treg方向傾斜時，UC可緩解。

中醫學潰瘍性結腸炎可歸屬于 “痢疾”“泄瀉”“腸癖”“大瘕泄”等范疇。本文第2作者朱瑩在近10年的前期研究發現大多數UC患者表現為脾腎陽虛的癥狀為主，實為病延日久，損傷腎陽，腎陽不足，命門火衰，不能溫煦脾土，陽氣不能溫煦，血行不暢，又“久病必瘀”，而導致氣血瘀滯，故提出UC的病機以“脾腎陽虛挾瘀”為主，并本著“治病求其本”的原則，創制出潰結寧膏，方中以炮附子、細辛、丁香、延胡索、赤芍、生姜、白芥子等作為主要成分，選取敷貼穴位：胃經的募穴“中脘”、大腸經的下合穴“足三里”及募穴“天樞”、補腎固元的“氣海”。現代腧穴學研究表明，足三里、氣海能增強機體免疫力，與天樞、足三里相配能改善腸道微循環，從而消除炎癥，修復損傷的腸黏膜屏障。潰結寧膏經皮膚、穴位持續作用于全身，達到對UC的治療作用。課題組前期臨床研究證實潰結寧膏穴位貼敷治療UC具有較好的臨床療效，其機制可能與抑制自身免疫性炎癥機制相關［4-5，16，19］。

本實驗觀察到改善大鼠一般臨床表現方面，各組采取相應治療措施治療后，敷貼組及SASP組大鼠較模型組體質量、飲水量增長，肛溫升高，提示潰結寧膏穴位敷貼可有效改善UC（脾腎陽虛證）大鼠臨床癥狀。腸道炎癥方面，與正常組相比，模型組DAI、CMDI、TDI均明顯增高，說明UC（脾腎陽虛證）大鼠出現便溏、大便隱血陽性、體質量減輕、結腸組織出現糜爛甚至潰瘍，炎性細胞的浸潤十分明顯；與模型組比較，敷貼組及SASP組DAI、CMDI、TDI均顯著下降，說明潰結寧膏穴位敷貼及SASP灌胃可以改善UC（脾腎陽虛證）大鼠便血情況，加快體質量增長，促進黏膜愈合，減少中性粒細胞的浸潤，潰結寧膏穴位敷貼可改善腸黏膜炎癥。炎性因子方面，采用ELISA對血清及結腸組織中IL-17、Foxp3表達進行檢測，與正常組對比，模型組大鼠血清及結腸組織中IL-17的表達明顯增高，Foxp3水平明顯下降，與模型組比較，敷貼組及SASP組大鼠IL-17水平明顯降低、Foxp3水平明顯增高，說明潰結寧膏穴位敷貼及SASP灌胃可明顯降低UC（脾腎陽虛證）大鼠血清及結腸組織中炎性因子IL-17的水平，并能增高抑炎轉錄因子Foxp3的水平，減少腸道炎癥反應。

綜上所述，UC（脾腎陽虛證）發病與IL-17水平增高、Foxp3水平降低呈相關性，而潰結寧膏穴位敷貼可明顯改善UC（脾腎陽虛證）大鼠一般臨床表現，顯著降低促炎因子IL-17表達、增高抗炎因子Foxp3表達，調節Th17/Treg的平衡，維持腸道黏膜免疫功能平衡，從而有效地治療UC（脾腎陽虛證）。