燈盞花素注射液對急性腦缺血/再灌注損傷模型大鼠凝血功能及腦血管內皮功能的影響*

朱愛萍 王 麗 李 清△

（1.湖北省十堰市太和醫院，湖北醫藥學院附屬醫院，湖北 十堰 442000；2.湖北省十堰市人民醫院，湖北 十堰 442000）

燈盞花素注射液是從菊科植物短葶飛蓬、燈盞花全株中提取分離所得的黃酮類有效成分，具有抗血栓形成、抗凝血、抗心肌缺血，改善微循環及血液流變性、增加腦血流量、提高機體耐缺氧能力等作用［1］。臨床用于治療腦出血所致后遺癥、腦供血不足、腦血栓、高黏脂血癥、心絞痛、冠心病等疾病［2］。有研究表明其可通過促進血管新生、清除自由基而發揮急性腦缺血/再灌注損傷的保護作用［3］。但在針對急性腦缺血/再灌注可能因凝血功能異常而發生如出血傾向、血栓形成或彌散性血管內凝血（DIC）等引起的血管內皮損傷，以及與調節血管內皮依賴性舒張功能相關因子如一氧化氮（NO）釋放及內皮型一氧化氮合酶（eNOs）基因表達等方面鮮有相關實驗研究，本研究系統觀察了燈盞花素注射液對MCAO模型大鼠上述指標的影響，分析其如何通過凝血酶激活途徑影響凝血功能，以及其對NO釋放及eNOs基因表達的影響，揭示其調節血管內皮功能、保護腦內皮免受上述因素造成的損傷機制，以期為臨床用藥提供理論依據。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠60只，雄性，SBF級，體質量180～190 g，實驗動物由湖北醫藥學院實驗動物中心提供［許可證：SCXK（鄂）2017-0008］。

1.2 藥物與試劑 燈盞花素注射液（石藥銀湖制藥有限公司， 批號：Z17021942）；NO、eNOs檢測 ELISA 試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，批號：H17023，H1724）；TXA2、t-PA及PAI試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司，批號：0173h40，0173h44，17006）；PGI2 檢測試劑盒（上海信裕生物科技有限公司量，批號16049）；TT、Xa和凝血酶活性熒光定量檢測試劑盒 （上海杰美基因醫藥科技有限，批號：E0722，E17110，E1627）。

1.3 造模與分組 用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠（按3.0 mL/kg劑量麻醉），注射水合氯醛后約5 min，針刺足底檢查麻醉效果，當翻正反射及疼痛均消失時即可開始手術。大鼠取仰臥位，固定大鼠門齒，剃去頸胸部鼠毛后消毒，縱行切開頸正中皮膚（約2 cm），鈍性分離皮下組織和肌肉，暴露左側頸總動脈，沿頸總動脈血管縱行鈍性分離出頸內動脈及頸外動脈。結扎頸外動脈血管后剪斷，并用高頻電凝電刀夾閉血管止血，沿頸內動脈向遠心端分離出進入顱內的翼腭動脈，在頸內動脈近心端下置一根手術線，然后分別用微動脈夾夾閉翼腭動脈遠心端和頸內動脈近心端，在緊靠頸內動脈近心端備用手術線處用眼科剪剪一小口，取用0.9%氯化鈉注射液浸泡的備用栓線小心插入，當栓線到達翼腭動脈微動脈夾夾閉處時，松開微動脈夾，緩慢推進到標記處，當手感遇到阻力即可。此時栓線已到達willis環，不可再用力，否則可能刺破willis環造成蛛網膜下腔出血，栓線阻斷供血90 min后抽出以恢復大腦血流。分層縫合頸部皮下組織和肌肉、消毒。待大鼠清醒后，參照Longa 5級4分制神經學評分進行評分，評分在1~4分的大鼠為造成功。其中0分：為正常體征，大鼠清醒后未出現異常的神經系統體征。1分：提起大鼠時右側上肢不能完全伸展。2分：提起大鼠時右前爪內收并握緊爪子，行走時向右側旋轉。3分：行走時向對側完全傾倒，動物不能正常行走。分組：術后12 h，剔除造模后死亡及蛛網膜下腔出血的24只。選擇經Longa神經學評分符合急性腦缺血/再灌注損傷標準的36只成模大鼠，隨機均分為對照組、葉酸組和燈盞花素組。

1.4 給藥方法 各組均從尾靜脈注射給藥治療14 d（均每日1次），其中對照組按每只大鼠0.2 mL注射0.9%氯化鈉注射液，葉酸組按每只大鼠1 mg注射葉酸注射液，燈盞花素組按每只大鼠1 mg注射燈盞花素注射液。

1.5 標本采集及檢測 1）治療第14日，采用Longa神經學評分比較治療前后3組神經功能恢復情況。2）剪斷大鼠尾部（約2 mm），迅速取500 μL靜脈血低溫凍存備用；斷尾取血后同時記錄BT及CT時間。BT采用斷尾法記錄：斷尾取血用濾紙每15 s吸符尾尖溢出之血液，至出血停止時間即為BT時間。CT時間采用玻片法：在檢測BT的同時，用濾紙吸去第1滴血，將鼠尾靜脈血滴到玻片上（直徑約5 mm），間隔15 s用大頭針從邊緣向內側輕挑1次，以出現纖維蛋白絲為CT時間。3）BT及CT時間記錄完后，斷頭法處死大鼠，迅速取開顱，小心錄取腦組織，分離出腦缺血區組織，采用HE染色法檢測病理學改變。4）取willis動脈，采用發色底物法檢測willis動脈環內皮組織t-PA及PAI活性。5）采用固相夾心法酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測大鼠willis動脈環NO、eNOs及血漿PGI2含量；采用放射免疫法測定TXA2含量。6）取低溫凍存備用的靜脈血，采用凝血因子生成實驗觀察大鼠靜脈血內/外源性凝血因子Xa活性。7）采用發色底物法測定血漿凝血酶含量及TT。

1.6 統計學處理 應用SPSS12.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，對于經方差分析符合正態分布的采用t檢驗，方差不齊采用校正t檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組 t-PAT、PGI2、TXA2、PAI、NO 及 eNOs 水平比較 見表1。與對照組比較，葉酸組NO及eNOs水平均顯示提高，兩組比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。葉酸對 Tt-PAT、PGI2、TXA2、PAI水平無明顯影響，故葉酸組 t-PAT、PGI2、TXA2、PAI水平與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。燈盞花素組t-PAT活性和PGI2含量提高，而TXA2含量、PAI活性、內/外源性凝血因子Xa和凝血酶含量均降低，與對照組和葉酸組比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表 1 各組 t-PAT、PGI2、TXA2、PAI、NO 及 eNOs比較（±s）

表 1 各組 t-PAT、PGI2、TXA2、PAI、NO 及 eNOs比較（±s）

與對照組比較，*P＜0.05；與葉酸組比較，△P＜0.05。 下同

組 別 n t-PAT（IU/mL）PGI2（ng/mL）PAI（IU/mL）TXA2（ng/L）NO（ng/mL）eNOs（pg/mL）對照組 12葉酸組 12 1.69±0.54 56.37±7.25 12.59±2.31 1.73±0.48 58.24±6.51 12.05±2.73 197.54±12.76 194.28±20.14 8.14±0.79* 6.27±0.53*19.24±2.05*△ 10.86±1.03*△燈盞花素組 122.86±0.75*△ 80.50±7.29*△ 8.94±0.92*△130.57±16.69*△18.28±2.72△ 9.69±0.91△

2.2 各組凝血功能比較 見表2。葉酸對內/外源性凝血因子Xa和凝血酶生成、CT、TT及BT均無明顯影響，與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。燈盞花素內/外源性凝血因子Xa、凝血酶生成減少，CT、TT及BT延長，與對照組和葉酸組比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 各組治療前后Longa神經學評分比較 見表3。治療前后對照組Longa神經學評分比較差異無統計學意義（P＞0.05）。葉酸組Longa神經學評分明顯降低，與治療前和對照組比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。燈盞花素組Longa神經學評分顯著降低，與對照組、葉酸組和治療前比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表2 各組凝血功能比較（±s）

表2 各組凝血功能比較（±s）

組 別 n CT（s） BT（s） TT（s） 凝血酶（U）內源性凝血因子 Xa（pg/mL）外源性凝血因子 Xa（pg/mL）對照組 12葉酸組 12 81.27±7.34 402.97±59.81 179.29±20.13 82.07±9.69 406.25±60.34 181.04±19.67 15.36±2.71 16.73±1.95 80.97±10.81 79.34±6.57 82.23±7.96 77.85±6.26燈盞花素組 12102.48±19.55*△ 549.29±47.58*△ 221.97±26.55*△11.58±2.80*△67.34±6.01*△ 63.54±7.81*△

表3 各組治療前后Longa神經學評分比較（分，±s）

表3 各組治療前后Longa神經學評分比較（分，±s）

與本組治療前比較，#P＜0.05；與對照組治療后，*P＜0.05；與葉酸組治療后比較，△P＜0.05

組 別 n 治療前 治療后對照組 12 4.27±0.35 4.41±0.27葉酸組 12 4.23±0.37 2.96±0.21*#燈盞花素組 12 4.30±0.31 1.85±0.16*△#

2.4 各組腦組織病理檢查結果 見圖1。腦缺區HE染色顯示，對照組腦缺區可見神經細胞排列紊亂、胞核溶合，出現壞死灶。葉酸組HE染色未見壞死灶，但有少量神經細胞排列紊亂、胞核溶合現象較對照組明顯少。燈盞花素組細胞排列紊亂及溶合現象較對照組明顯好轉且優于葉酸組。

圖1 各組腦組織病理學檢查結果（HE染色，400倍）

3 討 論

血管活性物質NO為機體重要的舒血管因子，可通過血管內皮細胞自分泌、內分泌和旁分泌等不同途徑分泌，參與調節血管緊張性、對血栓形成、平滑肌細胞增殖、動脈粥樣硬化、白細胞黏附及血管壁炎癥反應均具有抑制作用［4］。NO主要由激活的eNOs催化產生，故兩者存在著正反饋調節機制，eNOs活性增強可崔化NO合成與釋放，而NO增多有利于抑制血管內皮細胞活化和血小板聚集［5］。NO在缺血/再灌注中發揮著雙重調節機制，NO釋放減少會導致血管內皮依賴性舒張功能降低，從而增加腦梗死及缺血性腦卒中的發生，而NO釋放過多又會引起平滑肌細胞過度增殖及血小板的黏附降低，這會增加腦出血的發生風險［6］。由此可見，NO在腦梗死或腦出血的病理過程中均發揮著重要作用，而調節eNOs基因表達在維持血管內皮功能方面具有重要的研究價值。腦缺血/再灌注損傷是急性腦血管病發生與發展的重要病理生理基礎，會影響到纖溶系統的激活通路，包括促凝活性增強、抗凝活性減弱。腦研究表明，急性腦缺血/再灌注損傷是造成顱腦損傷的重要誘因，而顱腦損傷可引起如DIC等凝血功能紊亂等凝血功能異常現象，這也是造成顱腦損傷者死亡的主因［7］。因DIC的出血及血栓栓塞常引起廣泛的血管內皮損傷引，其造成的多器官功能障礙綜合征將導致患者死亡，故防止DIC，保護血管內皮在防治心腦血管性疾病方面具有重要意義。機體凝血功能由多因素參與，其中血小板微粒體中前列腺素H2經血栓素A合酶的催化下產生TXA2合成，TXA2釋放后可激活血小板并使其聚集，具有強烈促進血管收縮作用，在組織損傷時可減輕炎癥反應、促進創傷愈合［8］。PGI2也是由血管壁內皮細胞合成和釋放，具有舒張血管及抗血小板聚集的生物活性，在炎癥反應中可產生炎性疼痛［9］。在生理狀態下，組織或血漿或PGI2和TXA2保持動態平衡，當其平衡失調（PGI2生成減少或TXA2合成增多）均可能導致血小板聚集、血管出現痙攣收縮，這是血栓形成根本原因之一［10］。因此，測定PGI2和TXA2在血漿或組織中的濃度對臨床血栓性疾病的發病預測及療效判斷均具有重要的意義［11］。t-PA是一種絲氨酸蛋白酶，可以將纖溶蛋白酶原轉化為纖溶蛋白酶，從而促進纖維蛋白溶解，t-PA由血管內皮細胞合成、分泌的一種單鏈糖蛋白，對纖維蛋白有高度親和力，在釋放入血液后將酪氨酸纖溶酶原全成為纖溶酶、從而降解纖維蛋白原和凝血因子［12］。因此，提高t-PA活性、降低PAI活性或增加PGI2生成均可改善血管內皮功能，調節機體凝血與纖溶功能［13］。

葉酸注射液為強力血管保護劑，可增強eNOs活性，刺激血管內皮細胞合成和釋放NO，增強血管舒張功能［14］。在本研究中作為陽性對照，其可顯著提高eNOs活性并促進血管內皮細胞合成和釋放NO，葉酸組NO、eNOs均較對照顯著升高。而燈盞花素注射液也具有葉酸促進eNOs和NO的功能，燈盞花素組NO、eNOs均顯著升高。另外，燈盞花素注射液還可提高t-PAT活性和PGI2含量、降低TXA2合成、抑制PAI活性的作用。在治療14 d后，燈盞花素組t-PAT活性和PGI2含量提高，而TXA2含量和PAI活性明顯降低，與對照組和葉酸組比較差異有統計學意義。燈盞花素組CT、TT和BT較對照組和葉酸組延長，內/外源性凝血因子Xa和凝血酶含量降低，對凝血功能產生明顯的影響。

以上觀察結果表明，燈盞花素注射液可能通過提高eNOs活性來促進內皮細胞合成NO，再通過NO發揮擴血管效應，這一作用與血管保護劑葉酸極其相似。另外，燈盞花素對損傷組織凝血功能也產生明顯的影響，其機制與抑制PAI活性、提高t-PAT活性并促進PGI2生成、使內/外源性凝血因子Xa和凝血酶生成減少有關。燈盞花素可降低TXA2合成，使血小板激活及聚集受到抑制而不能發揮促血管收縮作用，可降低血栓產生的風險，這一作用的直按結果是延長CT、TT及BT時間。這與蘇延玲等［15-16］研究結果高度一致。

綜上所述，燈盞花素注射液具有保護急性腦缺血/再灌注損傷模型大鼠腦血管內皮細胞功能、防止凝血功能紊亂的作用。經腦區HE染色還發現燈盞花素注射液對急性腦缺血/再灌注損傷模型大鼠腦缺區神經細胞具有保護作用，燈盞花素組細胞排列紊亂及溶合現象較對照組明顯好轉且優于葉酸組，在改善Longa神經學評分方面較葉酸強，說明燈盞花素注射液具有改善腦損傷神經功能的作用。從以上觀察結果來看，燈盞花素注射液的抑凝血效應明顯，這對減少急性腦缺血/再灌注后血栓形成產生積極的作用，在臨床治療急性腦梗死后，降低血栓形成、保護血管內皮方面產生了積極的治療作用。