蒲公英多糖穴位離子導入對急性乳腺炎大鼠炎性因子的改善作用*

金佳佳 陳建華 季曉亮 楊偉剛

（浙江省湖州市中醫院，浙江 湖州 313000）

急性乳腺炎是乳房急性感染性疾病，主要為金黃色葡萄球菌感染，本病占乳腺感染性疾病的75%，在哺乳期多發，初產婦更為多見，發病多在產后3~4周［1］。據文獻報道，20%的哺乳期婦女曾患哺乳期急性乳腺炎［2］，一旦延誤治療，乳腺膿腫的發病率顯著上升。乳腺膿腫治療周期長，要經歷乳腺膿腫穿刺或手術引流等有創性操作，影響乳房外觀和產后哺乳，不利于身心健康。所以，如何有效地治療急性乳腺炎已經成了一個迫在眉睫的問題。而現代多項研究表明，蒲公英對治療急性乳腺炎效果顯著［3］。為此，本實驗觀察蒲公英多糖穴位離子導入對急性乳腺炎大鼠的抗炎作用。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年SD雌性已孕大鼠100只，體質量 220～260 g，80～110 d齡，采購于浙江中醫藥大學動物實驗中心（動物實驗許可證：X1602249）。大鼠飼養于浙江中醫藥大學動物實驗中心，屏障系統飼養室［溫度（22±1） ℃，濕度 50%～70%，光照 150～200 Lx，噪音＜50 dB］，12 h明暗循環，各數據均能自動控制和顯示。大鼠全部滅菌，自由采食全價營養顆粒飼料，自由飲用高壓滅菌水。

1.2 儀器與設備 ABE-Ⅲ型智能通絡治療儀 （鄭州愛博爾醫療設備有限公司生產）；AG204-電子分析天平，瑞士METTLER公司；AF100雪花狀制冰機，美國SCOTSMAN公司，STP120脫水機、AP280-2包埋機、HM335E切片機、HMS70染色機，MICROM公司，YS100顯微鏡，日本NIKON公司（以上均由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供使用）；無菌操作臺（蘇州凈化設備廠，SW～CJ～ZF）；CR21 型高速冷凍離心機（HITACHI生產）；動物測溫儀（北京鴻鷗成運科技有限公司，型號 TH212）測溫范圍：-30～50 ℃，精度：±0.2 ℃，分辨率：0.1℃，標準傳感器規格：Φ33 20 mm（大鼠）；導藥襯墊為自制，用半徑為2.1 cm的圓形8層無菌紗布制成；大鼠固定板（自制）；1 mL一次性注射器、5 mL一次性注射器、量筒、量杯、燒杯、鑷子、止血鉗、手術剪、眼科剪、試管、吸管、微量移液器、絲線、醫用紗布膠布、棉簽等。

1.3 藥物與試劑 蒲公英多糖［西安千草生物技術有限公司，規格 30%（UV 紫外檢測），批號：001］；阿莫西林（廣州白云山天心制藥股份有限公司，規格0.25g，國藥準字H44024600）。金黃色葡萄球，購自浙江中醫藥大學動物實驗中心，平板稀釋計數法將濃度調整1.5×108CFU/mL；TNF-α、IL-1β 和 IL-6 血清酶免試劑盒，購于武漢谷歌生物科技有限公司；蘇木精-伊紅用于組織切片的染色 （HE染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司，批號：G1120）［4］；蒸餾水（自制），生理鹽水，10%的甲醛溶液，龍膽紫，碘伏，醫用75%乙醇，醫用凡士林等（上海榮柏生物技術有限公司生產）。

1.4 造模與分組 動物在溫度20～25℃、相對濕度60%左右、水和標準飼料充足條件下飼養，稱重后按照隨機數字表法分為5組，每組20只：分別為空白對照組、模型組、蒲公英穴位離子導入高強度組、蒲公英穴位離子導入低強度組、阿莫西林組。各組雌鼠產后1～6 d后經10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，用75%的酒精對第4對乳腺區域進行消毒。除空白對照組外，其余4組80只雌鼠麻醉后固定，用小鑷子輕輕夾起乳頭，用帶鈍性針頭的1 mL注射器輕輕刺破皮膚經乳頭管插入，每側注入50 μL的1.5×108CFU/mL金黃色葡萄球菌懸濁液。80只大鼠中75只大鼠感染16 h后腹部可見輕微腫大，第4對乳腺區域腫脹變硬，充血，體溫升高，飲水和采食改變，豎毛、精神萎靡，蜷縮在籠子一角，活動量減少，整體觀察與空白對照組有明顯不同，表明模型復制成功。

1.5 實驗方法 1）動物穴位定位。穴位的定位選取根據李忠仁主編的《實驗針灸學》［5］，以比較解剖和骨度分寸法為依據。乳根：在胸部，第5肋間隙，前正中線旁開4寸。膻中：在胸部，橫平第4肋間隙，前正中線上。2）蒲公英多糖離子導入液配制。蒲公英多糖：取蒲公英干品回流提取、離心，沉淀部分用無水乙醇脫水2次，返溶凍干，凍干品為粗多糖。取粗多糖溶于超濾水中，濾液過柱，洗脫液經8 kD膜包超濾，收集循環液，凍干為總多糖。同時收集透過液，濃縮凍干，為小分子對照品。取蒲公英多糖60 g，予1000 mL蒸餾水稀釋，備用。3）動物治療及對照處理。造模成功24 h后，高強度組大鼠取仰臥位并固定于大鼠固定板，將前胸部皮膚備皮并充分顯露，將治療儀輸出線一端插入輸出孔，另一端的正、負兩個治療電極板內放入已在蒲公英多糖離子液中浸濕的自制襯墊；先用75%的酒精涂擦前胸部皮膚，再將正、負電極板分別置于“乳根”及“膻中”穴上，接通電源選擇電流深度為6級，強度為45 Hz進行治療；低強度組大鼠電流強度為30 Hz，其余處理同高強度組；空白對照組與模型組大鼠于造模24 h后，自制襯墊予蒸餾水浸濕，其余處理同高強度組；阿莫西林組予阿莫西林混懸液（含藥150 mg/kg灌胃）。各組大鼠分別按照以上方法進行處理，不同的電流強度大鼠均能耐受，每次20 min，每日1次，1周為1個療程，連續治療2周觀察相應指標。期間飼料和飲用水準備充足。1.6 觀察指標 1）病理觀察。用頸椎脫臼方法處死大鼠，選取第4對乳腺區，以乳頭為中心取直徑為1 cm，深度穿透皮膚層進行取材，取致炎術后各組大鼠乳腺組織，行免疫組化試驗并作病理切片，比較對照組與給藥組間組織病理學變化之差異。2）血清TNF-α、IL-1β和IL-6含量。根據大鼠當天體質量給予0.3 mL/100 g水合氯醛，待其麻醉后，在木板上固定，切開腹腔，暴露腹主動脈，持一次性采血針頭（前針頭）平刺腹主動脈，見血后將采血針尾端（后針頭）插入抗凝真空負壓采血管內，取血液1 mL后更換非抗凝管取血液3 mL。采血后抗凝真空負壓采血管上下顛倒混合5～10次。對采血管進行標記。由我院檢驗科測定白細胞計數。將非抗凝采血管放置于離心機中，離心轉速約為2000 r/min，離心15 min后取上清液0.8 mL，采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測大鼠各指標的含量。3）乳腺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達：取各組乳腺組織一份固定于10%的甲醛溶液中48 h。經過逐級乙醇脫水，二甲苯透明、浸蠟，石蠟包埋，超薄切片，備用。將石蠟包埋的乳腺組織切成3 μm薄片、脫蠟、水化、蒸餾水等沖洗，經過蘇木精-伊紅染色后，在顯微鏡下觀察各組乳腺組織形態學改變，包括水腫、炎性細胞浸潤等情況。

1.7 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，計量資料應用t檢驗和秩和檢驗評價試驗結果。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組病理切片結果 見圖1。空白對照組：大鼠乳腺腺泡結構完整，未看到明顯的病理變化。模型組：外膜間質有淋巴細胞 ，腺泡上皮細胞脫落，有明顯充血情況，空泡變性。蒲公英穴位離子導入高強度組：腺泡未脫落，治療效果最好。阿莫西林組：輕微充血，有上皮細胞脫落；癥狀減輕，外膜結構清晰。蒲公英穴位離子導入低強度組：腺泡飽滿，充血不明顯，癥狀明顯減輕，外膜未見淋巴細胞，正常腺泡較多，個別有脫落。

圖1 各組大鼠乳腺病理組織學切片（HE染色，400倍）

2.2 各組血清中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量 見表1。與空白對照組相比，模型組血清中的TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的含量顯著升高 （P＜0.05）；與模型組相比，蒲公英穴位離子導入高強度組、蒲公英穴位離子導入低強度組、阿莫西林組血清TNF-α、IL-1β和IL-6的含量均顯著降低（P＜0.05）。

表1 各組血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量比較（±s）

表1 各組血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量比較（±s）

與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。 下同

組別 n IL-6（pg/mL）空白對照組 20 8.81±2.11模型組 20 153.44±37.15*阿莫西林組 20 127.42±28.36△TNF-α（ng/L） IL-1β（pg/mL）11.51±3.42 57.25±15.13 39.37±12.12*186.35±38.43*30.23±8.36△ 154.25±37.13△低強度組 20 85.16±19.43△21.34±7.31△ 108.36±27.21△高強度組 20 14.61±5.43△ 73.53±19.12△ 34.25±5.33△

2.3 各組乳腺組織TNF-α、IL-1β和IL-6表達比較見表2。與空白組比較，模型組乳腺組織中的TNF-α、IL-1β和IL-6的表達量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，蒲公英穴位離子導入高強度組、蒲公英穴位離子導入低強度組、阿莫西林組中乳腺組織中的TNF-α、IL-1β和IL-6的表達量明顯降低（P＜0.05）。

3 討 論

急性乳腺炎多發于哺乳期，病因分感染性和非感染性兩種［6］，前者多由金黃色葡萄球菌感染所致，一般有紅腫熱痛，或發熱等全身癥狀，很多哺乳期女性會經歷輕重程度不同的的乳腺炎，嚴重影響泌乳，不利于母嬰身心健康［7-9］。西醫一般常規采用抗生素治療，此方法不僅影響哺乳，而且經乳汁的抗生素可進入嬰兒體內，影響嬰兒發育［10-11］。

表2 各組乳腺組織TNF-α、IL-1β和IL-6表達比較（±s）

表2 各組乳腺組織TNF-α、IL-1β和IL-6表達比較（±s）

組 別 n IL-6（pg/mL）空白對照組 20 1.00±0.13模型組 20 36.45±0.89*阿莫西林組 20 12.42±0.67△TNF-α（ng/L） IL-1β（pg/mL）1.01±0.01 1.00±0.08 4.36±0.19* 13.07±0.86*1.31±0.06△ 9.55±0.35△低強度組 20 1.42±0.81△0.51±0.05△ 2.36±0.31△高強度組 20 0.82±0.04△ 0.42±0.03△ 0.69±0.07△

其中TNF-α、IL-1β、IL-6等是目前公認的主要促炎因子，這些因子在生物損傷和SIRS的病理過程中發揮重要作用，其通過分泌量增加及各種炎癥因子的瀑布式釋放產生炎癥反應。TNF-α在細菌等感染后直接升高，特異性高，是炎癥反應的首要因素；IL-1β則是通過改變前炎癥介質或抗炎癥細胞因子的表達和影響組織多型核中性粒細胞聚集而促進炎癥的發展，引起組織細胞損傷［12-13］；IL-6對B細胞、T細胞增殖、分化均有促進作用，同時IL-6與其受體結合活化絲氨酸/蘇氨酸激酶促 CRP產生［14］，參與機體炎癥反應、免疫調節等過程［15］，故 IL-1β、IL-6 對炎癥反應的發生起到協同作用。

蒲公英味苦甘，性寒，無毒，入肝、胃經，具有清熱解毒、消腫散結、止痛散瘀、養陰涼血、通乳益精、利尿通淋等功效［16］。現代藥理研究表明，蒲公英中含有多種有效成分，如胡蘿卜素類、三萜類、植物甾醇類、倍半萜內酯類、香豆素類、黃酮類等［17］。炎癥是臨床最為常見的病理過程之一，因此抗炎中藥的研發尤為重要。蒲公英分布廣泛，價格低廉，目前蒲公英外敷治療急性乳腺炎的研究較多，且效果確切，但蒲公英提取物聯合穴位離子導入這種新型的給藥方式的研究甚少，且作用機制尚未明確。

本研究顯示與模型組比較，蒲公英多糖穴位離子導入能明顯減輕乳腺組織的病理損傷，蒲公英多糖高強度組、蒲公英多糖低強度組、阿莫西林組血清中的炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量明顯下降，差異具有統計學意義（P＜0．05），且乳腺組織中 TNF-α、IL-1β和IL-6的表達量均顯著降低，有統計學意義 （P＜0.05）。由此得出，蒲公英多糖能夠有效降低急性乳腺炎大鼠的炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平，抑制炎癥反應，保護和修復乳腺組織細胞，且進一步證實蒲公英多糖通過高強度穴位離子導入的給藥方式抗炎作用更強，穴位離子導入能夠促進藥物的滲透與吸收。穴位離子導入法在直流電的作用下，用直流穩壓電源，使藥物離子循序漸進地透過皮膚導入穴位。其優勢明顯，首先藥物不經過肝臟“首過效應”和胃腸道破壞，降低毒副作用，可維持穩定、持久的血藥濃度；其次穴位是臟腑氣血匯集之處［18］，現代科學證明了人和動物的經絡穴位具有較周圍皮膚阻抗低、電容大等特征，且經絡穴位對滲透藥物的效果更佳。劉建平等［19］用氨茶堿膜劑平喘作用實驗，證實穴位電阻值確實低于非穴位電阻值，且能促進藥物的吸收。但穴位離子導入具體的信號通路應進一步研究和探討。

總之，蒲公英多糖穴位離子導入法，根據中醫經絡理論將中藥提取物、經絡穴位與離子導入有機融合，既有穴位刺激作用，又有中藥治療效果，具有明顯的疏通經脈、調和氣血的功效［20］，在局部產生藥物濃度的相對優勢，發揮最大的全身藥理作用。而本研究這種新型的給藥方式能夠抑制急性乳腺炎大鼠促炎細胞因子的產生及表達，最終發揮抗炎作用，為臨床治療急性乳腺炎提供了新的思路。