羧甲基化改性制備 高保水、軟凝膠型卡拉膠

劉曉婷,安鳳平,王藝偉,黃 群,滕 慧,宋洪波

(福建農林大學食品科學學院,福建福州 350002)

卡拉膠是提取自紅藻的水溶性膠體,其中κ-卡拉膠是目前應用最為廣泛的一種卡拉膠,具有獨特的熱可逆凝膠性質和抗蛋白凝結性等特點[1-2],在食品工業、化學工業、包裝行業、制藥等領域已經廣泛應用[3-4]。

傳統方法加工的κ-卡拉膠,特別是高強度卡拉膠在實際應用中膠體易收縮,具有泌水性、保水性能差的缺點,其應用受到限制。近年來、高保水、軟凝膠等特種膠體的市場需求量越來越大,其中高保水、軟凝膠兼備的膠體因具有更好的持水穩定性及柔和的凝膠特性,可賦予產品穩定的組織形態及軟彈性特征,因此在乳制品、飲料、肉制品等食品加工領域以及精細化工、生物醫藥中有良好的應用前景[5-7]。目前,軟凝膠的研究主要集中在ι-卡拉膠[6-7];有研究表明,制備κ-卡拉膠過程中,在煮膠工序加入膠聯系劑以改善膠體的保水性[8]。通常,根據市場需求的軟凝膠膠體的凝膠強度應小于300 g/cm2,高保水膠體的析水率不大于0.5%,優質軟凝膠膠體應具備較低的凝膠強度和小的析水率。目前關于以κ-卡拉膠為原料,改性制備高保水、軟凝膠型卡拉膠的研究尚未見報道。

本文研究羧甲基化反應改性κ-卡拉膠,使卡拉膠中的羥基被羧甲基取代,以低析水率為主要目標,同時兼顧較低的凝膠強度,對反應條件進行優化;運用紅外光譜掃描、核磁共振探討改性機理,為高保水、軟凝膠型卡拉膠的加工提供理論和方法依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

κ-卡拉膠 福建綠新食品有限公司;無水乙醇、氫氧化鈉、氯化鉀、醋酸 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;氯乙酸 分析純,天津風船化學試劑有限公司。

DS32-ⅢB型雙螺桿擠壓機 濟南賽信機械有限公司;HH-6型恒溫水浴鍋 金壇市雙捷試驗儀器廠;101-0型鼓風干燥機 上海陽光試驗儀器有限公司;FZl02型微型植物粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;NG1型指針型凝膠強度測定儀 中國科學院海洋研究所;BS124S型電子分析天平、TE612-L型電子天平、PB-10pH計 賽多利斯科學儀器有限公司;FTIR-8400S型傅立葉變換紅外光譜儀 日本島津公司;ADVANCE III HD 400M型核磁共振儀 瑞士布魯克公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 改性卡拉膠的制備 采用螺桿擠壓機預處理κ-卡拉膠粉,螺桿擠壓處理工藝條件為:水料比2.0∶5 mL/g、溫度75 ℃、螺桿轉速100 r/min;40 ℃恒溫干燥24 h,粉碎后過80目篩,得預處理卡拉膠粉。

取10.00 g預處理卡拉膠粉,加入100 mL一定濃度的乙醇溶液并攪拌使卡拉膠均勻分散,分別加入4 mL濃度為20%(w/w)氫氧化鈉溶液至反應體系中，使氫氧化鈉濃度為0.8%,于35 ℃水浴保溫1 h;滴加一定量的氯乙酸鈉溶液(由氯乙酸與等摩爾比的20%氫氧化鈉水溶液中和制備得到),按一定的溫度反應3 h后,冷卻至室溫;用1 mol/L醋酸調節pH至7.0,抽濾后用相應濃度的乙醇溶液洗滌濾餅3次,收集濾餅,40 ℃恒溫干燥24 h,粉碎過80目篩得改性卡拉膠粉末[8]。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 氯乙酸鈉添加量對改性效果的影響 固定羧甲基化反應溫度45 ℃、乙醇濃度60%,按照氯乙酸鈉添加量分別為0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030 mol進行實驗,考察氯乙酸鈉添加量對卡拉膠析水率和凝膠強度的影響。

1.2.2.2 羧甲基化反應溫度對改性效果的影響 固定氯乙酸鈉添加量0.01 mol、乙醇濃度60%,反應溫度分別為40、45、50、55、60、65 ℃,考察羧甲基化反應溫度對卡拉膠析水率和凝膠強度的影響。

1.2.2.3 乙醇濃度對改性效果的影響 固定氯乙酸鈉添加量0.01 mol、羧甲基化反應溫度45 ℃,考察乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%對卡拉膠析水率和凝膠強度的影響。

1.2.3 響應面優化試驗 根據單因素試驗結果,以析水率為主要考察指標、凝膠強度為輔助考察指標,選取氯乙酸鈉添加量(A)、羧甲基化反應溫度(B)、乙醇濃度(C)3個因素為自變量,析水率(Y1)、凝膠強度(Y2)為響應值,設計響應面試驗,因素水平如表1所示。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levelsTable of response surface experiment

1.2.4 析水率及凝膠強度的測定 將3.00 g改性卡拉膠粉末加入到250 mL燒杯中,量取4 mL 10% KCl溶液,混合均勻,再添加200 mL蒸餾水,95 ℃水浴加熱1.5 h,分成三份裝在30 mL塑料量杯中,蓋上蓋子,待冷卻后于恒溫箱中放置14 h,對制備得到的改性卡拉膠凝膠測定析水率及凝膠強度,平行3次取平均值[4,9-10]。

析水率的測定:精確稱取1.2.4中得到的一定質量卡拉膠凝膠,用濾紙吸干凝膠表面水珠后再次進行精確稱重,析水率按公式(1)計算:

K(%)=[(m1-m2)/m1]×100

式(1)

式中:K:試樣的析水率(1.5%改性卡拉膠溶液的凝膠,20 ℃),%;m1:初始凝膠質量,g;m2:除去表面水珠后的凝膠質量,g。

凝膠強度的測定:將1.2.4中制得的改性卡拉膠凝膠樣品置于凝膠強度測定儀的試樣座上,首先記錄表盤的初始數值,打開開關,記錄凝膠瞬間破裂時表盤的數值,兩個數值之差即為凝膠強度[4]。凝膠強度計算如式(2):

P=G×f

式(2)

式中:P:試樣的凝膠強度(1.5%溶液的凝膠,20 ℃),g/cm2;G:測定的凝膠強度值,g/cm2;f:溫度校正系數,根據GB 1975-2010,30 ℃環境下的溫度校正系數為1.35。

1.2.5 紅外光譜 將干燥的卡拉膠樣品與溴化鉀按照1∶100～1∶150比例混合,充分研磨后,倒入儀器的模具中抽真空壓片,于12 MPa保持30 s,直到壓片呈現透明。傅立葉變換紅外光譜掃描儀掃描范圍為4500～500 cm-1,分辨率為4 cm-1,掃描次數16～32[11]。

1.2.6 核磁共振 將干燥的卡拉膠充分研磨后裝入樣品管中,采用Brucker DPX-400M型固體核磁共振儀對樣品進行13C-NMR譜測定。

1.3 數據處理與分析

采用Design-Expert V8.0.6及DPS 7.0統計分析軟件對數據進行處理,采用Microsoft Excel 2007及Origin 8.0作圖。

2 結果與分析

2.1 改性工藝條件優化結果分析

2.1.1 單因素試驗

2.1.1.1 氯乙酸鈉添加量對改性效果的影響 由圖1可知,在氯乙酸鈉添加量為0.005～0.030 mol范圍內,隨著氯乙酸鈉添加量的增多,改性卡拉膠的析水率和凝膠強度均持續減小。這是因為,隨著氯乙酸鈉添加量增多,羧甲基化卡拉膠生成量亦隨之增多,因此析水率及凝膠強度均隨之降低。考慮到氯乙酸添加量對析水率和凝膠強度具有明顯影響,因此確定氯乙酸鈉添加量0.020～0.030 mol作為優化試驗的范圍。

圖1 氯乙酸鈉添加量對析水率和凝膠強度的影響Fig.1 Effect of sodium chloroacetate addition on separating water rate and gel strength注:圖中字母不同表示組間差異顯著(p<0.05),下同。

2.1.1.2 羧甲基化反應溫度對改性效果的影響 由圖2可知,隨著羧甲基化反應溫度的升高,改性卡拉膠的析水率和凝膠強度逐漸減小。是因為反應溫度的升高有利于增大氯乙酸鈉向膠體內部擴散的速率,從而加快羧甲基化反應速率[12];綜合考慮,確定羧甲基化反應溫度55～65 ℃為優化試驗范圍。

圖2 羧甲基化反應溫度對析水率和凝膠強度的影響Fig.2 Effect of carboxymethylation temperature on separating water rate and gel strength

2.1.1.3 乙醇濃度對改性效果的影響 由圖3可知,隨著乙醇濃度的增加,改性卡拉膠的析水率和凝膠強度均隨之顯著減小(p<0.05);至80%以后,析水率減小的趨勢有所變緩。由于乙醇具備較大極性,對羧甲基化反應進行起到一定的促進作用[13],因此增大乙醇濃度,產物的析水率和凝膠強度均會減小;此外,由于H2O分子對卡拉膠具有溶脹作用,有助于將反應物小分子輸送到卡拉膠內部,促使反應進行,因而適量的水分是必須的。確定乙醇濃度60%～80%為優化的參數范圍。

圖3 乙醇濃度對析水率和凝膠強度的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on separating water rate and gel strength

2.1.2 響應面優化試驗

2.1.2.1 響應模型建立與分析 對表2中析水率(Y1)與氯乙酸鈉添加量(A)、羧甲基化反應溫度(B)、乙醇濃度(C)的關系進行擬合,并根據表3的方差分析結果,剔除不顯著項后得到二次多元回歸方程:

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results for response surface experiment

表3 析水率方差分析表Table 3 Variance analysis for separating water rate

Y1=0.25-0.024A-0.026B-0.18C+0.025AC+0.021BC-0.023A2-0.016B2-0.047C2

式(3)

由表3可知,對于析水率模型p<0.0001,模型極顯著;而失擬項p=0.3251>0.05,不顯著,表明該模型具有統計學意義,析水率模型的穩定性好。氯乙酸鈉添加量、羧甲基化反應溫度和乙醇濃度的一次項和二次項對析水率的影響均極顯著(p<0.01);氯乙酸鈉添加量和乙醇濃度的交互作用、羧甲基化反應溫度和乙醇濃度的交互作用均極顯著(p<0.01)。

同理,依據表2中凝膠強度以及表4中的顯著性分析結果,可得凝膠強度與氯乙酸鈉添加量、羧甲基化反應溫度、乙醇濃度關系的二次多元回歸方程為:

表4 凝膠強度方差分析表Table 4 Variance analysis for gel strength

Y2=263.74-22.02A-27.89B-225.77C+10.39AB+15.58AC+14.92BC-13.04A2-14.40B2+20.80C2

式(4)

由表4可知,凝膠強度模型的顯著性檢驗p<0.0001,而失擬項p=0.1028>0.05,說明該模型具有統計學意義,且穩定性好。氯乙酸鈉添加量、羧甲基化反應溫度、乙醇濃度3個因素的一次項、二次項及兩兩因素間的交互作用均極顯著(p<0.01)。

由F值的大小可知,對析水率和凝膠強度影響的主次順序均為:C>B>A,即乙醇濃度>羧甲基化反應溫度>氯乙酸鈉添加量。

2.1.2.2 響應面分析 由圖4可以看出,氯乙酸鈉添加量和羧甲基化反應溫度交互作用對析水率的影響不顯著;氯乙酸鈉添加量和乙醇濃度、以及羧甲基化反應溫度和乙醇濃度的交互作用對析水率的影響顯著。此結果與表3的顯著性分析結果一致。

圖4 兩因素交互作用對析水率的影響Fig.4 Effects of cross-interaction of two factors on separating water rate

由圖5可知,氯乙酸鈉添加量和羧甲基化反應溫度、氯乙酸鈉添加量和乙醇濃度、以及羧甲基化反應溫度和乙醇濃度交互作用對凝膠強度的影響均極顯著,與表4的顯著性分析結果一致。

圖5 兩因素交互作用對凝膠強度的影響Fig.5 Effects of cross-interaction of two factors on gel strength

2.1.2.3 最佳工藝條件確定及驗證試驗 由于改性卡拉膠的析水率越小,其凝膠強度亦越低,因此改性卡拉膠析水率并非越小越好。在保證析水率足夠低的同時,還應具備一定的凝膠強度(≤300 g/cm2),滿足軟凝膠的特性。以低析水率為主、凝膠強度為輔,因此運用式(3)所示三個因素與析水率關系模型,以析水率為0.15%,兼顧較低的凝膠強度,確定的工藝參數為:氯乙酸鈉添加量0.02 mol、羧甲基化反應溫度65.13 ℃、乙醇濃度69.35%。考慮到實驗可操作性，修正最佳條件為：氯乙酸添加量為0.02 mol、羧甲基化反應溫度65 ℃、乙醇濃度69%，在此條件下,制備卡拉膠的析水率為0.16±0.001%、凝膠強度為(205±1.22) g/cm2,與模型(3)和(4)預測值0.158%、208 g/cm2的相對誤差在1.5%以內。

經測定,未改性卡拉膠的析水率為4.60%±0.005%、凝膠強度為(2120±10.23) g/cm2。因此,改性卡拉膠的綜合性能得到極大改善,總體表現出優秀的保水性能和軟凝膠性能。

2.2 結果分析

2.2.1 紅外光譜分析 圖6為未改性κ-卡拉膠(KC)、改性卡拉膠(HRKC)的紅外圖譜,對于未改性κ-卡拉膠的紅外圖譜,其中3420 cm-1處吸收峰為-OH的伸縮振動吸收峰,2962 cm-1和2925 cm-1處吸收峰分別為甲基和亞甲基C-H鍵的伸縮振動吸收峰,1624 cm-1為糖的水化物的吸收峰,1260 cm-1表示硫酸基上O=S=O的伸縮振動峰,1159 cm-1處則為醚橋鍵的C-O-C特征峰,在1070 cm-1處是連接羥基的C-O-的伸縮振動吸收峰,928 cm-1位置是α-D-3,6內醚半乳糖上C-O-C的特征吸收峰,848 cm-1處為半乳糖C4-O-S的伸縮振動吸收峰[14-15]。

圖6 未改性κ-卡拉膠(KC)、 改性卡拉膠(HRKC)的紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectra of κ-carrageenan and modified carrageenan

與未改性的κ-卡拉膠紅外圖譜相比,改性卡拉膠在1624 cm-1處的吸收峰減弱,而1424 cm-1位置有了新的吸收峰,即羧甲基的-COO-的特征吸收峰;1327 cm-1處吸收峰的強度增加,表明連接羥基的C-O-鍵的數量增多了;3420 cm-1處的吸收峰強度有所減弱,表明在羥基相連接的位點發生了取代。由此表明,改性卡拉膠的糖單元結構中有羧甲基官能團引入;其它吸收峰未改變,說明卡拉膠的糖單元結構沒有被破壞。

圖7 未改性κ-卡拉膠核磁共振圖Fig.7 13C-NMR spectra of κ-carrageenan

圖8 改性卡拉膠核磁共振圖譜Fig.8 13C-NMR spectra of modified carrageenan

3 結論

本實驗對κ-卡拉膠進行螺桿擠壓預處理后,再進行羧甲基化反應改性,優化了羧甲基化的反應條件,并結合紅外光譜掃描及核磁共振對其改性機理進行了研究。結果表明:通過響應面法優化羧甲基化反應結合實際反應條件，修正后確定的優化條件為:氯乙酸鈉添加量0.02 mol、羧甲基化反應溫度65 ℃、乙醇濃度69%。在此條件下制備的改性卡拉膠的析水率為0.16%、凝膠強度為205 g/cm2,與未改性卡拉膠相比,析水率降低了96.5%,凝膠強度滿足

軟凝膠的要求。改性卡拉膠的糖單元結構中引入了羧甲基官能團,原有的結構未遭到破壞,因此析水率有效降低的同時,凝膠強度亦明顯降低。