草莓酵素發酵過程中 氨基酸成分分析和蛋白質營養評價

陳小偉,程勇杰,范昊安,薛淑龍,蔣立新, 張 婷,王珍珍,毛旸晨,沙如意,*,毛建衛,*

(1.浙江科技學院生物與化學工程學院,浙江杭州 310023; 2.浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室,浙江杭州 310023; 3.浙江省農業生物資源生化制造協同創新中心,浙江杭州 310023; 4.杭州醫學院,浙江杭州 310053)

植物酵素是以一種或多種蔬菜、水果和豆谷類、海藻類、藥食兩用本草類、菌菇類植物等為原料,加(或不加)糖類物質,經加入單種或多種益生菌發酵(或不加菌依靠植物表面本身保留的微生物發酵),經過低溫長時間發酵而產生的功能性微生物發酵產品[1-2]。草莓作為大眾喜歡的水果,營養價值豐富,被譽為“水果皇后”[3],具有保健功能,兼有保護視力,助消化,防止便秘等功效[4]。其本身含有豐富的維生素C、多酚類、黃酮類、花青素等多種功能性成分[5]。

氨基酸是重要的生命物質,是組成生物體中酶和蛋白質的基本單元[6]。植物酵素中含有大量風味氨基酸和人體必需氨基酸,目前對于植物酵素蛋白質和氨基酸的研究主要包括蛋白質含量檢測[7]、氨基酸分析與功能因子的相關性[8],因此對植物酵素進行氨基酸分析與蛋白質的營養成分評估極有必要[9]。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是中樞神經系統中重要的抑制性神經遞質,GABA含量異常與人體多種神經和精神疾病,如帕金森綜合癥[10]、癲癇[11]、焦慮[12]等有關[13]。Ge等[14]研究發現GABA在成人大腦新生成的神經元突觸融合中起重要作用,神經元活動調節成人神經發生,新的神經元有助于特定的腦功能。目前還未見關于植物酵素氨基酸和蛋白質營養評價的研究報道,本文對草莓酵素氨基酸和蛋白質營養評價的同時,還利用氨基酸味覺閾對草莓酵素的風味進行評估,確定發酵過程中各種風味氨基酸對味覺的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草莓 采摘于杭州黃爺爺生態農業科技有限公司,選擇八分熟的新鮮無病蟲害,個體完整的草莓果實,個體重量為(23.00±6.00) g;發酵用糖漿和酵素菌液 由浙江省農副產品加工重點實驗室提供,采用常溫密閉,避光的自然發酵方式;考馬斯亮藍G250、重蒸酚 上海長哲生物科技有限公司;混合氨基酸標準溶液(含Asp、Glu、Met、Tyr、Phe等17種氨基酸)、GABA 色譜純,日本和光純業工業株式會社;檸檬酸鈉(2H2O)、氫氧化鈉、氯化鈉、茚三酮 優級純,國藥集團化學試劑有限公司;丙二醇單甲基醚、無水醋酸鈉、乙醇、冰醋酸 色譜純,阿拉丁試劑有限公司;純凈水 娃哈哈集團。

KQ-300E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;DZF-6020型真空干燥箱 上海邁源環境實驗設備有限公司;PTX-FA210型電子天平 福州華志科學儀器有限公司;JT-DCY-12Y型水浴氮吹儀 杭州聚同電子有限公司;Allegra X-12R型離心機 貝克曼庫爾特有限公司;L-8900型氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 草莓酵素的制備 采用程勇杰[8]等的方法。用滅菌好冷卻后的無菌水輕洗草莓樣品表面,常溫下自然瀝干。瀝干后去蒂直接切成薄片,按草莓和糖液(w∶w=3∶4)30 kg快速加入高壓蒸汽滅菌過的發酵罐,加入10%(v/v)的酵素菌液(菌體濃度:1×105CFU/mL),密閉、25 ℃室溫避光發酵。實驗3次平行。定時取一定量發酵液,在6000 r/min轉速下離心15 min,取上層清液于-85 ℃超低溫冰箱保存待測。樣品發酵取樣時間分別為10、20、30、50、75、110、140、155 d。

1.2.2 蛋白質含量測定 采用考馬斯亮藍G250法[15]測定發酵液中蛋白質含量。準確稱取考馬斯亮藍G250試劑100 mg,溶于50 mL 95%乙醇,加入85%(w/v)磷酸,用水稀釋至1000 mL備用,利用牛血清白蛋白制備標準曲線,線性方程y=0.0055x+0.064,R2=0.9994。實驗前取出冷凍后的草莓酵素,與30 ℃水浴30 min,取200 μL草莓酵素,加水至1000 μL,然后加入5 mL配制好的考馬斯亮藍G250溶液,混勻,靜置反應10 min,以去離子水做空白對照,在595 nm波長下測定吸光度,計算蛋白質含量。

1.2.3 樣品前處理和氨基酸分析 用酸水解法進行樣品處理[16]:取冷凍后于30 ℃水浴30 min后的草莓酵素1 mL于水解管中,加入HCl∶H2O=1∶1(v/v)的HCl溶液10 mL,重蒸酚175 μL,振蕩混勻,在冰水浴中冷卻5 min后吹入氮氣保護,于110 ℃數顯恒溫鼓風干燥箱中水解22 h。水解液經冷卻,過濾、沖洗、定容至50 mL容量瓶中。再取2 mL濾液,45 ℃真空干燥,完畢后,加入1 mL去離子水同條件再次烘干,加入1 mL 0.02 mol/L檸檬酸鈉緩沖液,過0.22 μm微孔濾膜,等待上機進樣。

氨基酸分析儀操作條件參照GB 5009.124-2016[17],流動相:檸檬酸鈉緩沖溶液,控制流速:0.4 mL/min;進樣量:20 μL;分離柱柱溫:57 ℃;反應柱柱溫:135 ℃;檢測波長:脯氨酸檢測波長440 nm,其它氨基酸檢測波長570 nm。以峰面積作為檢測結果,采用外標法計算氨基酸濃度。

1.2.4 氨基酸營養價值與風味評價 采用1973年FAO/WHO建議的氨基酸評分標準進行評價[18-20],評價范圍包括氨基酸評分(Amino acid score,AAS)、氨基酸比值(ratio of amino acid,RAA)、氨基酸比值系數(ratio coefficient of amino acid,RC)、比值系數分(score of ratio coefficient of amino acid,SRC)。具體計算方法如下,

氨基酸得分(AAS)(%)=[某必需氨基酸含量(g/100 g粗蛋白)]/[FAO/WHO模式中該必需氨基酸含量(g/100 g粗蛋白)]×100

氨基酸比值(RAA)(%)=[某必需氨基酸含量(g/100 g粗蛋白)]/[模式中該必需氨基酸含量(g/100 g粗蛋白)]×100

SRC=100-CV×100

氨基酸風味成分按照氨基酸含量用味覺閥值比[21]來分析,評價指標為含量閥值比(ratio of content and taste threshold,RCT)。

1.3 數據處理

本實驗對各個時間點不同參數進行測定,實驗重復次數n=3,氨基酸含量取3次實驗平均值,氨基酸組成評價與蛋白質營養評價以“平均值±標準偏差”表示。蛋白質、必需氨基酸和GABA含量變化采用Origin 8.6繪圖,氨基酸聚類分析采用SPSS 18.0處理。

2 結果與分析

2.1 草莓酵素發酵過程中蛋白質含量變化

圖1是不同發酵時間發酵液中可溶性蛋白質含量變化趨勢,在發酵的前20 d,幾乎檢測不到蛋白質。在20～30 d,蛋白質含量迅速上升,在此時間范圍內,充足的糖分和原料本身的營養物質,使微生物大量繁殖代謝生成蛋白質,同時原料中的蛋白質隨著發酵的進行,也會浸漬到發酵液中。在30～75 d,蛋白含量呈緩慢增加的趨勢,至75 d含量達到最高,為137.68 μg/mL,隨后蛋白質含量有所下降,在第110 d降至103.03 μg/mL,然后再呈緩慢增加的趨勢。袁周率等[7]通過對糙米酵素發酵前后糖類、蛋白質、氨基酸等研究發現,發酵前后可溶性糖從4.62%降至4.34%,蛋白質含量從0.51%升至0.58%。陳燕飛[22]指出,微生物在低滲透壓食品中容易生長,在高滲透壓下易于脫水死亡,只有少數酵母可耐受高滲透壓環境。故發酵前期,微生物在高濃度糖漿造成極高的滲透壓下難以生長繁殖,發酵液中可溶性蛋白質含量較少。隨著反應時間的延長,草莓本身的水分滲出,充足的糖分和原料本身的營養物質,微生物開始快速利用豐富的碳源生長繁殖。蔣增良[23]通過研究樹莓發酵過程中蛋白質的含量變化發現,發酵前64 d,蛋白質含量一直呈現上升趨勢,在0～40 d增長了近兩倍,增長速率最快。后期由于微生物對糖類物質的利用和次級代謝產物的積累導致部分微生物和細胞分解成小分子物質,蛋白質含量下降。110 d后,發酵液中的蛋白質含量輕微上升,可能是微生物對原料本身進行分解,導致原料蛋白質逐漸溶出或菌體自溶所致。

圖1 不同發酵時間草莓酵素發酵液中的可溶性蛋白質含量Fig.1 Soluble protein content in strawberry jiaosu at different fermentation times

2.2 草莓酵素發酵過程中氨基酸含量變化

2.2.1 發酵過程中氨基酸組分變化 為考察自動氨基酸分析儀檢測方法的線性關系,準確配制了濃度分別為2、5、20、50和100 nmol/mL的17種氨基酸和GABA混合標準溶液。圖2為18種氨基酸(含GABA)的標準圖譜,一通道(570 nm)下氨基酸在32 min內全部分離出,GABA出峰時間為21.55 min;二通道(440 nm)脯氨酸(Pro)在8 min前出峰完全。結果表明18種氨基酸分離效果良好。以峰面積為縱坐標,各種氨基酸濃度為自變量繪制標準曲線,線性關系良好,各相關系數均大于0.99,如表1所示。

圖2 標準混合氨基酸圖譜Fig.2 Chromatogram of standard amino acids

表1 氨基酸標準曲線Table 1 Standard curves of amino acids

采用外標法分析和計算不同發酵時間的草莓酵素樣品中氨基酸含量,結果表明在發酵過程中檢出的氨基酸包括天冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Thr)、絲氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、纈氨酸(Val)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、GABA、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)和脯氨酸(Pro),其中含量最高的2種氨基酸分別為Glu和Asp,而甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)和組氨酸(His)未檢出。由于采用強酸對樣品中的蛋白質和多肽水解時,水解過程中色氨酸(Trp)遭到破壞[24],因此在本方法下,草莓酵素中的Trp均未被檢測到。

表2是草莓酵素發酵過程中各氨基酸組分含量變化情況,在發酵第10 d,發酵液中總氨基酸(不含GABA)含量較低,僅為0.288 mg/mL。發酵至10～30 d,總氨基酸含量迅速升至0.471 mg/mL。在發酵第30～140 d,總氨基酸含量呈總體平穩并緩慢增加。在草莓酵素發酵過程中,含量最高的2種氨基酸分別為Glu和Asp,發酵至第10 d,2種氨基酸的含量為0.101和0.105 mg/mL,分占總氨基酸含量的35.43%和36.65%,兩者總和接近總氨基酸含量的3/4,而兩種氨基酸在后續的發酵過程中含量無明顯變化。在人體內,Glu可與血氨結合形成谷氨酰胺,有利于肝臟的解毒功能,同時也可活躍人體的腦組織代謝,而Asp可緩解骨骼和牙齒的損害。一般而言,在草莓酵素發酵過程中Cys含量較為穩定,而Tyr在發酵第30 d才被檢測到,其它檢測到的氨基酸均呈先上升,再趨于穩定的趨勢。姜遠茂[25]等對哈達和豐香等4種草莓的氨基酸含量分析,發現四種草莓中Asp和Glu含量均最高,這也與草莓酵素發酵過程中觀察到的主要氨基酸結果相一致。石彥國[26]等也指出草莓原料中Asp含量高達176 mg/100 g,因此發酵液中的Glu、Asp可能與草莓原料本身的溶出有關。袁周率[7]通過對糙米酵素發酵前后氨基酸含量研究發現,發酵后部分氨基酸含量有所上升,其中Ala上升了17.74%。

表2 草莓酵素發酵過程中氨基酸含量變化(mg/mL)Table 2 Change of amino acid content in ferment of strawberry jiaosu(mg/mL)

2.2.2 發酵過程氨基酸種類特性的聚類分析 對草莓酵素不同發酵時間氨基酸的聚類分析結果如圖3所示,其中1～8分別代表發酵時間為10、20、30、50、75、110、140和155 d。由圖3可知,根據發酵時間,可將氨基酸聚類為四類。即第1類:10 d,第2類:20 d,第3類:30、50、75 d,第4類是110、140、155 d。聚類分析的結果代表著不同發酵時間,氨基酸含量從極低到緩慢增加,再到趨于穩定的總趨勢,與利用氨基酸分析儀得到的不同發酵時間氨基酸變化趨勢結果相一致。

圖3 草莓酵素發酵過程中氨基酸變化時間特征聚類圖Fig.3 Characteristic clustering of amino acid change in different fermentation times of strawberry jiaosu

2.2.3 草莓酵素發酵過程中GABA的變化 如圖4所示,發酵前20 d,GABA含量明顯上升,在發酵第20 d含量達到最高,為23.48 mg/L,隨之,含量急劇下降,在發酵第50 d,濃度降到2.27 mg/L。隨后又呈緩慢上升的趨勢,發酵至155 d的含量與第10 d含量相接近。這有可能是發酵前期,在微生物分泌的蛋白酶作用下將蛋白質水解,造成游離氨基酸如Glu等增多,而微生物(如乳酸菌)分泌的Glu脫羧酶催化谷氨酸合成GABA導致其濃度增加[27]。

圖4 發酵過程中GABA含量變化Fig.4 Changes in GABA content during fermentation

2.3 草莓酵素發酵過程中氨基酸營養評價

2.3.1 草莓酵素中必需氨基酸含量 如圖5所示,在草莓酵素發酵過程中必需氨基酸含量不斷上升,在發酵第10 d僅為0.024 mg/mL,發酵第30 d上升至第10 d的2倍。經過155 d的發酵,必需氨基酸含量上升至0.104 mg/mL,相比發酵第10 d提高了3.33倍。呂春茂等[28]發現蘋果渣發酵后必需氨基酸含量從0.87 mg/mL增加到5.33 mg/mL,從某種意義上來講,必需氨基酸含量與營養價值具有一定的相關性。

圖5 草莓酵素發酵過程中必需氨基酸含量變化曲線Fig.5 Changes of the essential amino acid content in the fermentation process of strawberry jiaosu

2.3.2 草莓酵素中必需氨基酸組成評價 對于營養價值較高的蛋白質,首先要求必需氨基酸種類齊全,其次氨基酸之間的比例也同樣重要。合適的比例才能與人體需求相符合,必需氨基酸吸收更完全,營養價值更高[29]。將草莓發酵液中必需氨基酸與FAO/WHO模式氨基酸譜進行對比,從而得出氨基酸得分,結果見表3。

表3 草莓酵素中必需氨基酸組成評價Table 3 Composition evaluation of essential amino acid in strawberry jiaosu

其中AAS值越接近于1,蛋白質營養價值越高;AAS值小于1或大于1,分別表示為蛋白質營養不足或營養過剩[30]。

由于在發酵的前20 d,蛋白質含量較低,低于考馬斯亮藍法檢測蛋白質的濃度極限,因此未對發酵10 d和20 d的發酵液進行營養評估。發酵第30 d后,除Met外,其它8種必需氨基酸評分均>1,屬于較為嚴重的營養過剩,特別是Thr和Cys。在草莓酵素發酵過程中總氨基酸含量增加(如表2),總蛋白質含量卻相對穩定(如圖1),同時必需氨基酸所占總氨基酸比例增加,導致各種氨基酸得分相應地增加。

2.3.3 草莓酵素蛋白質的營養評價 氨基酸比值[31]定義為一定量食物中氨基酸的含量相當于模式氨基酸的倍數。RC用于判定限制氨基酸和計算限制氨基酸的強化量,可用模式氨基酸相當量的一份樣品中氨基酸的比值來表示。如果樣品中氨基酸的組成與模式氨基酸模式相等,則RC等于1,同理,當RC>1,則表示相應氨基酸相對過剩,RC<1時表示相應氨基酸相對不足。SRC主要用于蛋白質營養價值的評價。理論上,SRC值越接近于100,蛋白質的營養價值越高。

對不同發酵時間草莓酵素RAA、RC和SRC進行計算,結果如表4所示,第一限制氨基酸為酪氨酸(Tyr)+苯丙氨酸(Phe)。發酵30 d后,SRC值均高于55,尤其是發酵50 d后,在穩定的微環境和較為穩定的菌種活性條件下下,SRC值呈逐漸增加的趨勢。在整個發酵過程蛋白質營養價值由高到低依次是:155 d>140 d>110 d>30 d>75 d>50 d,這一結果與氨基酸聚類分析的第3類和第4類相一致。

表4 草莓酵素蛋白質的營養評價Table 4 Nutritional evaluation of proteins of strawberry jiaosu

2.3.4 氨基酸風味成分分析 天然氨基酸主要為L構型,而眾多的L型氨基酸是食品中新鮮口感的主要貢獻成分,如谷氨酸鹽作為食品調味劑已被人們使用多年。在草莓酵素發酵過程中,分解產生的氨基酸和本身的游離氨基酸是影響草莓酵素風味的主要因素。依據氨基酸的味覺強度,大致可將氨基酸分為鮮味氨基酸(Asp、Glu、Lys)、甜味氨基酸(Thr、Ser、Gly、Ala、His、Pro)、苦味氨基酸(Val、Met、Ile、Leu、Arg)和芳香族氨基酸(Cys、Tyr、Phe)[19]。

表5為草莓酵素4種不同風味氨基酸在發酵過程中含量的變化趨勢,隨著發酵時間的延長,鮮味氨基酸含量趨于穩定;甜味氨基酸、芳香族氨基酸和苦味氨基酸含量不斷升高。尤其是苦味氨基酸,在發酵后期其含量是其它風味氨基酸的幾十甚至上百倍。忽略在草莓酵素發酵過程中添加的糖類物質對風味的影響,單純從氨基酸含量上來看,在發酵前期,影響草莓酵素風味的物質為鮮味氨基酸和苦味氨基酸;在發酵后期,主要是苦味氨基酸占據絕對優勢。

表5 發酵過程中不同風味氨基酸含量Table 5 Contents of different flavors of amino acids during fermentation

然而風味氨基酸的含量與對酵素風味貢獻并不一定呈嚴格的正相關性,這主要是由于不同氨基酸的味覺閥值不同,氨基酸濃度與味覺閥值的對比稱為RCT[32]。RCT<1,氨基酸對風味無貢獻;只有當RCT≥1時,氨基酸才對風味有貢獻。且RCT值越大,相應氨基酸對食品的風味貢獻越大。表6計算了草莓酵素在發酵過程中各種風味氨基酸的含量閥值比,在發酵過程中,除Asp和Glu兩種鮮味氨基酸的RCT值大于1,其它15種氨基酸對發酵液的風味均無明顯的貢獻,說明Asp和Glu兩種氨基酸對草莓酵素發酵液的風味有主要貢獻。然而在發酵過程中,Asp和Glu的含量變化趨勢并不明顯,而且由表2可知2種氨基酸的含量在整個發酵過程中變化也不明顯。因此,從氨基酸角度講,隨著發酵時間的延長,草莓酵素的苦味、甜味、芳香等風味變化不明顯,主要還是以鮮味為主要風味。當然,原料成分、微生物代謝產物的影響也可能會造成草莓酵素發酵液口感的變化。

表6 草莓酵素中各種風味氨基酸的含量閥值比(RCT)Table 6 Threshold content ratio of each flavor amino acid in strawberry jiaosu(RCT)

3 結論

對草莓酵素蛋白質和氨基酸含量及營養價值進行分析,結果表明,蛋白質含量在發酵前期明顯增加,發酵至75 d含量達到最高,為137.68 μg/mL,隨后緩慢降低,但相比發酵前有顯著提升(p<0.05)。總氨基酸含量與必需氨基酸含量也有較明顯提高,說明一定時間的發酵能提高酵素中蛋白質和氨基酸的含量,且提高程度較明顯。GABA含量在發酵前20 d經過急劇變化后,再經過一定時間的發酵,GABA含量與發酵前并無明顯差異,說明發酵對GABA的消耗再后期可以得到彌補。草莓酵素中氨基酸較為齊全,營養豐富,在整個發酵過程中,SRC值始終高于55,且數值處于上升趨勢。由此可見,適當的延長發酵時間可有效提高草莓酵素的營養均衡度。就氨基酸呈味發酵過程中只有Asp和Glu兩種鮮味氨基酸的RCT值大于1,對味覺有影響,但由于其它成分如有機酸和其它活性物質的影響,發酵過程中氨基酸含量的變化對味覺的影響不大。