牛肉中沙門氏菌熱失活模型的建立

朱立賢,鄭 婷,董鵬程,張一敏,毛衍偉,梁榮蓉,馬文健,羅 欣,*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東泰安 271018; 2.威海海洋職業(yè)學(xué)院,山東威海 264300; 3.陽(yáng)信縣畜牧獸醫(yī)局,山東陽(yáng)信 251800)

沙門氏菌作為一種重要食源性致病菌,其引發(fā)疾病的特征性臨床癥狀主要有急性胃腸炎、敗血癥和傷寒、副傷寒等[1]。由于沙門氏菌對(duì)人類的危害嚴(yán)重且分布廣泛,因此世界各國(guó)常通過(guò)檢測(cè)沙門氏菌是否存在,作為食品衛(wèi)生與否的一個(gè)重要的指標(biāo)[2]。美國(guó)每年有140萬(wàn)人通過(guò)食物源感染沙門氏菌[3]。在中國(guó),40%～60%的食源性疾病是由沙門氏菌引起的[4]。在各類食品中,動(dòng)物性食品如牛肉、豬肉、蛋、乳類等是引起沙門氏菌病暴發(fā)的主要媒介[5-6]。我國(guó)牛肉中沙門氏菌的檢出率為3%～6%[7-9]。

沙門氏菌是主要的食源性致病菌之一,極易通過(guò)糞便、皮毛及交叉污染散播到肉牛屠宰和加工環(huán)境中,進(jìn)而對(duì)分割牛肉造成一定的污染。采取有效的殺菌方法對(duì)預(yù)防沙門氏菌病具有重要作用。食品的殺菌方法有很多種,如熱殺菌、非熱殺菌(超高壓、微波、輻射、高壓脈沖電場(chǎng)殺菌)、添加各種防腐劑或抑菌劑等,而實(shí)現(xiàn)非熱殺菌在實(shí)際生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用還有一段距離,對(duì)食品工業(yè)和消費(fèi)者來(lái)說(shuō)熱處理殺菌仍是最有效、最簡(jiǎn)便、使用最廣泛的殺菌方法[10-11]。在很多情況下,細(xì)菌的熱失活曲線并不遵循對(duì)數(shù)線性關(guān)系,在擬合細(xì)菌熱失活曲線時(shí)經(jīng)常出現(xiàn)非線性的現(xiàn)象[12]。近年來(lái),Weibull模型被廣泛的應(yīng)用于食品微生物失活模型的擬合[13-14]。Chun等[15]研究了輻照對(duì)即食火腿中沙門氏菌失活模型的影響,Weibull模型很好地?cái)M合了失活曲線。Chen[16]對(duì)牛奶中沙門氏菌的壓力失活模型進(jìn)行了評(píng)價(jià),Weibull方程和Logistic方程的擬合性好于線性方程。韓洪玲等[17]研究表明,Weibull 模型可用來(lái)擬合金黃色葡萄球菌對(duì)超高壓失活的抗性曲線,擬合效果優(yōu)于Gompertz模型和線性模型。

國(guó)內(nèi)有關(guān)致病菌預(yù)測(cè)模型的研究大多采用的是單一血清型菌種的人工污染[17-18],不同血清型沙門氏菌的耐熱性不同[19]。美國(guó)農(nóng)業(yè)部食品安全檢驗(yàn)局建議使用不同血清型的混合菌株進(jìn)行模擬接種試驗(yàn),國(guó)外在建立沙門氏菌預(yù)測(cè)模型時(shí)大多是通過(guò)接種不同血清型的混合菌株進(jìn)行研究[20-21]。因此，本研究選取了4個(gè)不同血清型沙門氏菌的混合菌株(3株分離自牛肉,1株ATCC菌株)進(jìn)行熱失活研究,以便更好地模擬沙門氏菌的實(shí)際污染情況。本文研究了不同溫度熱處理對(duì)牛肉中沙門氏菌的影響,用Weibull模型擬合牛肉中沙門氏菌的非線性失活曲線,建立了牛肉中沙門氏菌的熱失活模型,為牛肉中沙門氏菌的控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

TSB(胰蛋白胨大豆肉湯) 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;Hektoen Enteric Agar HE培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;Bag Filter-400 拍打袋 法國(guó) Interscience公司;4株不同血清型的沙門氏菌混合菌株分別是腸炎沙門氏菌(Salmonella.Enteritidis)、德?tīng)柋吧抽T氏菌(Salmonella.Derby)、阿貢納沙門氏菌(Salmonella.Agona)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella.TyphimuriumATCC 14028),前三株均為山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物性食品研究室董鵬程博士保存的牛肉源沙門氏菌菌株;牛肉樣品是從山東某肉牛屠宰公司取的背最長(zhǎng)肌,放入帶冰的泡沫箱中3 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室備用。

Bag Mixer-400W均質(zhì)器 法國(guó)Interscience公司;Healsafe1200生物安全柜 法國(guó)力申科學(xué)儀器有限公司;CS504高級(jí)恒溫水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;Gilson P200移液器 濟(jì)南莊盟生物技術(shù)有限公司;HP-9272恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;DZ-300/2S小型程控全自動(dòng)真空封裝機(jī) 金橋科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的準(zhǔn)備 無(wú)菌操作取背最長(zhǎng)肌,在紫外燈下照射30 min后去除外周,無(wú)菌條件下將其切成1 mm厚的薄片,以每份(5.00±0.05) g進(jìn)行真空密封,然后保存于-20 ℃?zhèn)溆?使用前置于0～4 ℃無(wú)菌條件下解凍,解凍后至實(shí)驗(yàn)之前,樣品一直置于0～4 ℃條件下。

1.2.2 菌懸液的制備 無(wú)菌條件下,將4株不同血清型的沙門氏菌分別平板劃線后挑取單菌落,分別接入TSB液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h,得到生長(zhǎng)至穩(wěn)定期的菌懸液(經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)反復(fù)試驗(yàn)后的結(jié)果,4種菌株一樣的培養(yǎng)條件),4株菌制得的菌懸液濃度約為108CFU/mL,將其1∶1∶1∶1混合,得到混合菌株菌懸液。

1.2.3 接種及真空密封 參考馮曉慧等[22]的方法,無(wú)菌操作取樣品(5.00±0.05) g于菌懸液中浸蘸15 min(不斷攪拌),于無(wú)菌鐵網(wǎng)上晾2 h,然后裝于拍打袋中,用0.1 MPa的真空度抽真空,使密封的樣本充滿整個(gè)袋子并使其厚度小于1 mm,以確保傳熱的統(tǒng)一。同時(shí),按同樣的操作將未經(jīng)接種沙門氏菌菌液的肉樣浸蘸于無(wú)菌蛋白胨水中作為空白對(duì)照。

1.2.4 熱處理 將接種后的樣品分別置于55、57.5、60、62.5和65 ℃溫度條件的恒溫循環(huán)水浴鍋中進(jìn)行熱處理[23]。加熱時(shí)間從1.5～35 min不等(加熱時(shí)間的確定是綜合考慮預(yù)實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果和加熱溫度而定),熱處理溫度、時(shí)間與取樣頻率見(jiàn)表1。加熱時(shí),將樣品快速地浸入熱水中,按設(shè)計(jì)的時(shí)間間隔定時(shí)取出部分樣品進(jìn)行測(cè)定。將熱處理后的樣品取出立即放入冰水中阻止失活過(guò)程的繼續(xù)。每一組溫度時(shí)間的組合重復(fù)3次。

表1 熱處理的溫度、時(shí)間及時(shí)間間隔Table 1 Temperature,time and time intervals of thermal treatments

1.2.5 沙門氏菌計(jì)數(shù) 參考Yadav等[24]的方法,略有改動(dòng),取出冷卻過(guò)的經(jīng)熱處理的肉樣,表面用75%乙醇消毒,無(wú)菌條件下剪開(kāi),加入45 mL的0.1%無(wú)菌蛋白胨水,用均質(zhì)器以最大速度(8次擠壓/秒)拍打2 min,然后進(jìn)行梯度稀釋,取3個(gè)適宜濃度的稀釋液涂布在HE選擇性培養(yǎng)基上。涂布完成后,先將平板置于室溫下約2 h,以使熱受傷的細(xì)胞復(fù)蘇,然后于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù),算出平均值并轉(zhuǎn)換成lg(CFU/g)。

1.2.6 模型的建立和驗(yàn)證

1.2.6.1 沙門氏菌一級(jí)熱失活模型的建立 分別將牛肉中沙門氏菌在55、57.5、60、62.5和65 ℃熱處理?xiàng)l件下得到的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,用Weibull模型描述不同溫度條件下的殘存菌量與時(shí)間的關(guān)系。Weibull模型是將失活曲線看作細(xì)菌失活致死積累分布形式,這種累積形式可以用以下公式[25]來(lái)表示:

lg(Nt/N0)=-btn

式(1)

式中,N0為熱處理前樣品中沙門氏菌菌落數(shù)(CFU/g),Nt為熱處理后樣品中沙門氏菌菌落數(shù)(CFU/g),b為模型的規(guī)模參數(shù)(scale parameter),n為曲線形狀參數(shù)(shape parameter)。

1.2.6.2 熱處理溫度對(duì)失活模型參數(shù)影響的二級(jí)模型的建立 利用線性回歸的方法對(duì)沙門氏菌熱失活參數(shù)b的自然對(duì)數(shù)值與溫度(55～65 ℃)(式(2))進(jìn)行擬合,得到牛肉中沙門氏菌失活的二級(jí)模型。

lnb=aT-c

式(2)

式中b是Weibull模型中的參數(shù),a、c是常量系數(shù),T是溫度。

1.2.6.3 沙門氏菌的熱失活模型的驗(yàn)證 本研究采用的是外部驗(yàn)證[26],在55～65 ℃間隨機(jī)選58.5 ℃和65 ℃的熱失活數(shù)據(jù)對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)用建立的沙門氏菌熱失活動(dòng)力學(xué)模型求得58.5 ℃和64 ℃下的預(yù)測(cè)值,與在58.5 ℃和64 ℃熱處理實(shí)驗(yàn)中的沙門氏菌的實(shí)際檢測(cè)值進(jìn)行比較,采用準(zhǔn)確度Af、偏差度Bf、和均方根誤差(RMSE)來(lái)評(píng)價(jià)所建模型的可靠性[27],準(zhǔn)確因子、偏差因子和均方根誤差的表達(dá)式如下:

Af=10(∑|Npre-Nobs|)/n

Bf=10(∑(Npre-Nobs))/n

式中,Nobs是實(shí)際測(cè)得的沙門氏菌數(shù)量的對(duì)數(shù)值,Npre是應(yīng)用沙門氏菌熱失活模型得到的與Nobs同一時(shí)間的微生物數(shù)量的對(duì)數(shù)值,n是試驗(yàn)次數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)選取的Weibull模型進(jìn)行擬合建立一級(jí)模型,通過(guò)線性回歸建立溫度對(duì)一級(jí)模型參數(shù)影響的二級(jí)模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同熱處理?xiàng)l件下沙門氏菌的一級(jí)熱失活模型的建立

目前,建立致病微生物預(yù)測(cè)模型的培養(yǎng)基質(zhì)一般分為兩種,一是基于液體培養(yǎng)基,此方法簡(jiǎn)單、快速,比在真實(shí)食品上更容易控制不同的影響因子[28]。大部分已建立的模型都是在液體培養(yǎng)基上建立的,例如美國(guó)農(nóng)業(yè)部開(kāi)發(fā)的致病菌預(yù)測(cè)程序(PMP),英國(guó)的農(nóng)、漁、食品部(UKMAFF)與英國(guó)食品研究所(IFR)聯(lián)合開(kāi)發(fā)的食品微模型都是基于此[29],但缺點(diǎn)是沒(méi)有考慮到原料組織(脂肪含量,pH和水分活度)對(duì)微生物的實(shí)際影響,因此預(yù)測(cè)結(jié)果往往偏高[30-31]。二是以真實(shí)食品(肉類、果蔬制品、蛋類和乳類等)為基質(zhì)來(lái)獲得微生物的生長(zhǎng)或失活數(shù)據(jù)從而建立預(yù)測(cè)模型,雖然方法繁瑣,測(cè)定數(shù)值的精度低于液體培養(yǎng)基,但能充分考慮食品原料組織對(duì)微生物的實(shí)際影響作用,真實(shí)性高,所建動(dòng)力學(xué)模型能有效預(yù)測(cè)微生物在實(shí)際食品上的情況[32]。因此,本研究將沙門氏菌接種到牛肉表面建立沙門氏菌的熱失活模型。

采用Weibull模型擬合牛肉中沙門氏菌的熱失活曲線見(jiàn)圖1,相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表2。Weibull模型擬合的熱失活曲線的p值均小于0.01,判定系數(shù)R2分別為0.993(55 ℃)、0.984(57.5 ℃)、0.999(60 ℃)、0.999(62.5 ℃)和0.998(65 ℃),即在0.984～0.999之間,說(shuō)明Weibull模型能很好地?cái)M合牛肉中沙門氏菌的熱失活曲線。參數(shù)b是模型的尺度參數(shù),反映對(duì)細(xì)菌致死效果的優(yōu)劣,b值越大,說(shuō)明細(xì)菌活菌的瞬時(shí)降低速度越快,抵抗不利環(huán)境的能力就越差,b受熱處理溫度的影響[33]。在微生物的失活/致死動(dòng)力學(xué)的研究中,常因細(xì)菌含有亞菌群,導(dǎo)致存活曲線呈非線性,當(dāng)用微生物殘存菌量或菌數(shù)減少量-時(shí)間曲線來(lái)表達(dá)不同致死因子殺滅微生物的作用效果時(shí),一般會(huì)出現(xiàn)S形、凸形、凹形等曲線形式[33]。參數(shù)n是形狀參數(shù),一方面直觀反映失活曲線的形狀,另一方面n值的大小代表特定意義。n>1,曲線呈凸面,表明失活模型的曲線隨時(shí)間的增加呈加快的趨勢(shì),即時(shí)間越長(zhǎng),微生物越易死亡,熱處理對(duì)細(xì)菌有累計(jì)殺滅作用[34];n值越接近于1,說(shuō)明Weibull曲線越接近線形。當(dāng)n<1時(shí),模型呈現(xiàn)凹狀的存活曲線,n越小,存活曲線的下降趨勢(shì)減慢,說(shuō)明菌株的殘存菌量較高[35]。一般同一種處理對(duì)同種微生物的影響相似,n值變化不顯著,為了模型的簡(jiǎn)化,可將n值視為定值[33,36],本實(shí)驗(yàn)中n值平均值為0.59,曲線呈凹形,說(shuō)明隨著加熱時(shí)間延長(zhǎng)對(duì)沙門氏菌產(chǎn)生了拖尾效應(yīng),這與Mattick等[37]報(bào)道的培養(yǎng)基中沙門氏菌的熱失活曲線和Phungamngoen等[38]研究的沙門氏菌耐熱性的結(jié)果一致。類似的研究Li等[39]用Weibull模型擬合了花生醬中沙門氏菌熱失活曲線也呈下凹現(xiàn)象。

圖1 Weibull模型在55、57.5、60、62.5和65 ℃條件下擬合牛肉中沙門氏菌的熱失活曲線Fig.1 Thermal inactivation curve of Salmonella in beef under 55,57.5,60,62.5 and 65 ℃ applying Weibull model

表2 沙門氏菌熱失活模型的參數(shù)Table 2 Parameter values of the thermal inactivation model for Salmonella in beef

2.2 沙門氏菌二級(jí)失活模型的建立

由以上分析可知,應(yīng)用Weibull最適失活模型均能擬合不同溫度下沙門氏菌的熱致死情況,但卻無(wú)法描述不同加熱溫度的變化對(duì)沙門氏菌熱失活的影響,因此需要建立一個(gè)關(guān)于溫度對(duì)一級(jí)模型參數(shù)b影響的二級(jí)模型。由圖2可以看出,Weibull模型一級(jí)模型參數(shù)b受溫度的影響,隨著加熱溫度的升高,參數(shù)b不斷呈指數(shù)增大,其擬合方程為lnb=0.47T-28.07,相關(guān)系數(shù)R2為0.909,說(shuō)明該模型描述的溫度與一級(jí)模型參數(shù)b之間的關(guān)系是可信的。

圖2 溫度對(duì)Weibull模型參數(shù)b的影響Fig.2 Effect of temperature on the parameter b of the Weibull model

2.3 熱失活動(dòng)力學(xué)模型的驗(yàn)證

為了全面評(píng)價(jià)所建模型的可靠性,Ross[27]提出了準(zhǔn)確度和偏差度的概念,準(zhǔn)確度Af衡量預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)值之間的差異,偏差度Bf表示預(yù)測(cè)值上下波動(dòng)的幅度。本試驗(yàn)用在58.5和64 ℃條件下沙門氏菌存活的觀察值與應(yīng)用預(yù)測(cè)模型計(jì)算得到的沙門氏菌存活的預(yù)測(cè)值來(lái)計(jì)算準(zhǔn)確度Af偏差度Bf和RMSE,以綜合評(píng)價(jià)和驗(yàn)證模型的可靠性。

由表3可以看出,Af為1.071和1.056,說(shuō)明預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間的差異是在10%以內(nèi);Bf為0.998和1.002,說(shuō)明預(yù)測(cè)值上下波動(dòng)的幅度小于10%;RMSE值均小于0.12,誤差較小,進(jìn)一步說(shuō)明本研究建立的模型能很好地預(yù)測(cè)不同溫度處理對(duì)沙門氏菌的影響。

表3 58.5 ℃和64 ℃熱處理牛肉中沙門氏菌失活預(yù)測(cè)值的 準(zhǔn)確度(Af),偏差度(Bf)和RMSETable 3 Accuracy factor,bias factor and RMSE of Salmonella in beef at 58.5 and 64 ℃

3 結(jié)論

該文應(yīng)用Weibull模型擬合了不同熱處理?xiàng)l件下牛肉中沙門氏菌的失活曲線,相關(guān)系數(shù)(R2)在0.984～0.999之間,說(shuō)明Weibull模型能很好地?cái)M合牛肉中沙門氏菌的熱失活情況;建立了溫度對(duì)Weibull模型參數(shù)b影響的二級(jí)模型,即lnb=0.47T-28.07,相關(guān)系數(shù)(R2)為0.909。用58.5和64 ℃下實(shí)際的沙門氏菌存活數(shù)對(duì)所建的模型進(jìn)行驗(yàn)證,準(zhǔn)確度(Af)和偏差度(Bf)均在可接受范圍內(nèi),表明該模型能很好地預(yù)測(cè)牛肉中沙門氏菌在58.5和64 ℃下的失活動(dòng)態(tài)。本文得到的牛肉中沙門氏菌失活模型可以快速可靠的預(yù)測(cè)沙門氏菌在55～65 ℃之間的熱失活情況,可以作為熱處理殺滅牛肉中沙門氏菌的理論參考。