黃曲霉毒素B1降解菌的篩選及鑒定

王 威,謝巖黎

(河南工業大學糧油食品學院,河南鄭州 450001)

黃曲霉毒素(Aflatoxin,AFT)是一組由黃曲霉(Aspergillus.flavus)和寄生曲霉(Aspergillus.nomius、Aspergillus.parasiticus、Aspergillus.tamarii)等多種真菌經過聚酮作用產生的次級代謝產物[1-2]。其中Aspergillus.flavus主要產生B族黃曲霉毒素,Aspergillus.parasiticus產生B族和G族黃曲霉毒素[3-4]。目前已分離出20余種黃曲霉毒素,主要存在AFB1、AFB2、AFG1、AFG2,其他均為衍生物,如AFM，它是AFB在動物肝臟內經過羥化衍生而形成的代謝產物，它會分泌到乳汁(Milk)中,其中以AFB1的毒性最大，污染最廣,具有致癌性、致毒性、致突變性、抑制免疫力、肝損傷等[5-7]。

目前去除食品和飼料中黃曲霉毒素的方法主要有3種,物理法、化學法和生物法[8]。物理法主要有吸附劑、烘焙、紫外照射、電離輻射等。化學法主要有堿法、氧化法等,但是理化方法對食品的品質和營養有不同程度的影響,且容易造成化學殘留,設備成本高等問題。目前生物法是研究熱點,生物法去除黃曲霉毒素的方式有兩種,一是微生物吸附脫毒[9],菌體細胞吸附毒素形成穩定復合物,但是這一過程容易受到溫度和菌體濃度影響,過程可逆。二是微生物或其代謝產物降解脫毒。黃曲霉毒素B1降解是微生物的代謝產物或者酶破壞AFB1的毒性基團氧雜萘鄰酮和二呋喃環的過程,前者為致癌基團,后者為基本毒性結構[10]。生物法降解AFB1條件溫和,去毒效率高,且生物酶具有作用的專一性等優點。Guan等[11]以香豆素為唯一碳源和能源篩選出嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，其能夠顯著降解黃曲霉毒素B1,Hormisch等[12]以熒蒽為碳源，從多環芳烴污染的土壤中分離出分歧桿菌(Mycobacteriumfluoranthenivoranssp.)，該菌能在72 h內將一定量的AFB1全部降解。Liang等[13]從芽孢桿菌(Bacillusshackletonii)中分離出新型AFT降解酶,能夠降解AFB1、AFB2、AFM1。

本研究通過大量工作,從河南鄭州地區篩選到具有良好降解AFB1特性的菌株,對降解能力最優的菌株進行了初步鑒定,并對該菌株的AFB1脫毒機理和降解特性做了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

微生物樣品 來源于腐爛朽木、發霉糧食、發酵食品、霉菌污染的土壤以及加油站土壤(河南鄭州高新區)等。AFB1標準品 美國Sigma公司;香豆素 上海Macklin生化科技有限公司;甲醇、乙腈 色譜純,天津市四友精細化學品有限公司。

Agilent 1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司;KDC-160HR高速冷凍離心機 安微中科中佳科學儀器有限公司;PHS-3C型精度pH計 上海雷磁科學儀器股份有限公司;LY20-92B臺式恒溫振蕩器 上海龍躍儀器設備有限公司。LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;YT-CJ-1N型超凈工作臺 北京亞泰科隆儀器技術公司;BC-J160S電熱恒溫培養箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的配制 初篩培養基為Hormisch等[12]改良篩選培養基(L-1):0.25 g KH2PO4,1.0 g NH4NO3,1.0 g CaCl2,0.25 g MgSO4·7H2O,1.0 mg FeSO4,20 g瓊脂,2 g香豆素;種子培養基(營養肉湯)(L-1):3 g牛肉膏,10 g蛋白胨,5 g NaCI;發酵培養基(L-1):3 g牛肉膏,10 g蛋白胨,6 g葡萄糖,5 g NaCI;菌種保存培養基(L-1):3 g牛肉膏;10 g蛋白胨;5 g NaCI,20 g瓊脂,以上培養基pH均為7.0,121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2.2 降解AFB1菌株的分離與篩選

1.2.2.1 初篩 稱取樣品1 g,研缽磨碎后置于9 mL無菌生理鹽水中,搖床振蕩混勻2 h(150 r/min),吸取0.2 mL上清液接種于5 mL種子培養基中,37 ℃培養12 h,然后將菌液接種到初篩培養基中,37 ℃倒置培養1周,觀察菌株的生長情況,挑取有生長跡象的菌株,再次在初篩培養基平板上劃線、培養,如此反復轉接3～4次,挑取能在以香豆素為唯一碳源的培養基上生長的單菌落，保存備用。

1.2.2.2 復篩 取初篩菌株接種于5 mL種子培養基中,37 ℃、150 r/min氣浴搖床培養24 h,再以5%的接種量轉接于100 mL發酵培養基中,37 ℃,150 r/min氣浴搖床培養48 h,取975 μL菌體發酵液與25 μL AFB1標準品(100 μg/mL)混勻于1.5 mL的滅菌的棕色離心管中,混合后濃度為2.5μg/mL,以無菌的發酵液加AFB1標品作空白對照,37 ℃、150 r/min氣浴搖床暗處培養72 h,3組平行實驗,反應結束后,4 ℃、12000 r/min離心5 min去除菌體,取上清液測樣。

1.2.3 AFB1的提取及檢測 AFB1的提取和HPLC檢測方法參考Teniola的方法[14],取1 mL上清液,用等體積的二氯甲烷渦旋振蕩萃取3次,每次30 s,取二氯甲烷層,36 ℃下氮氣吹干,用1 mL色譜級乙腈溶解,經0.22 μm濾膜過濾后進樣。

液相條件:色譜柱為ZORBAX SB-C18柱(150 mm×4.6 mm,5μm);流動相為甲醇∶乙腈∶水=1∶1∶2(V∶V∶V),流速1 mL/min;柱溫30 ℃,檢測波長:362 nm。

AFB1的去除率利用以下公式計算:

去除率(%)=(1-實驗組AFB1含量/對照組AFB1含量)×100

1.2.4 菌株的鑒定

1.2.4.1 表型測定 接菌在肉湯培養基平板上,37 ℃培養24 h后，觀察形態、色澤,顯微鏡觀察細胞形狀以及革蘭氏染色結果。

1.2.4.2 細菌16S rDNA基因序列測定及同源性分析 使用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒。以引物對7F:5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′和1540R:5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′特異性擴增16S rDNA。PCR 擴增程序:94 ℃ 4 min;94 ℃ 45 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,30個循環:72 ℃ 10 min。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產物。采用試劑盒純化并克隆PCR產物,生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。將PCR擴增得到的16S rDNA序列用NCBI的BLAST程序進行序列同源性比對,并用MEGA 7軟件進行NJ(Neighbor-Joining)分析，并構建基于16S rDNA序列的系統發育樹,用Bootstrap法(1000次重復)檢驗。

1.2.5 菌株降解活性物質的確定 為初步確定能夠降解AFB1的活性物質,設立三組試驗:a. 胞外粗提液:將1.2.2中發酵液在4 ℃、8000 r/min離心20 min,取上清液,即得胞外粗提液。b. 菌細胞懸浮液:將a中離心后所得菌細胞用50 mmol/L,pH7.0的磷酸鹽沖洗兩次,用磷酸鹽緩沖液溶解。c. 胞內裂解物:用超聲細胞破碎儀將b中細胞懸液在冰上破碎(5 s,33 min,兩次),再將破碎的細胞溶液冷凍離心(4 ℃、12000 r/min離心5 min),隨后取上清液用0.22 μm的抽濾器無菌抽濾。

1.2.6 菌株降解曲線測定 將菌株接種到發酵培養基中,在37 ℃培養72 h后,與AFB1混合培養,測定不同培養時間(6、12、24、48、96 h)下AFB1的降解率。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 菌株的初篩

初篩獲得31株能在以香豆素為唯一碳源和能源的培養基中穩定生長的菌株,如表1所示,6株分離于土壤、6株來源于發霉糧食(小麥、玉米和糙米)、6株來源于腐爛朽木(楊樹、芝麻桿),5株來源于發酵食品,其他來源于花生粕與玉米胚芽粕,對以上菌株進行復篩。

表1 降解黃曲霉毒素B1菌株的初篩結果Table 1 Result of the firstly screened aflatoxin degradation strains

2.2 菌株的復篩

將初篩得到的31株菌株進行復篩,共得到10株降解活性良好的菌株(表2),其中XY1降解能力最強,降解率達到了71.91%,選擇菌株XY1進行后續研究。

表2 降解黃曲霉毒素B1菌株的復篩結果Table 2 Results of the secondly screened aflatoxin B1 degradation strains

2.3 菌株的鑒定

XY1菌株在培養基上生長為灰白色的菌落,革蘭氏陰性菌。16S rDNA基因是編碼原核生物核糖體小亞基的基因，長度在1500 bp左右，提取菌株XY1總DNA，進行PCR擴增，其PCR產物電泳圖如圖1所示，在1500 bp處出現特異性條帶，與預計結果相同。將XY1的16S rDNA(1444 bp)在NCBI用Blast比對,從GenBank數據庫獲得相關序列進行系統發育分析,由圖2可知，XY1與Klebsiellasp.(FR677021.1)位于一個分支中,與Klebsiellasp.同源性達到99%,可以初步確定XY1為克雷伯氏菌(Klebsiella),屬于克雷伯氏菌屬。

圖1 XY1菌基因PCR產物電泳圖Fig.1 PCR products of XY1 gene shown in agarose gel electrophoresis注：1:XY1菌基因PCR產物圖;M:Marker:DL5000。

圖2 基于16S rDNA基因構建的XY1鄰位連接法系統進化樹Fig.2 Neighbor-Joining phylogenetic tree of strain XY1

2.4 發酵液中降解AFB1物質的確定

從圖3中可以看出,XY1菌胞外粗提液的降解率明顯高于菌細胞懸液及胞內裂解物,胞外粗提液降解率為70.23%,菌細胞懸液降解率為8.26%,胞內裂解物的降解率為3.18%,其中菌細胞懸浮液對AFB1有一定的降解率,說明菌細胞對AFB1有一定的吸附作用,對比上清液的降解率后,可以確定是發酵液中菌株的胞外代謝產物起主要降解作用。在堿性環境下,AFB1的內酯鍵易受OH-的攻擊,從而引起內酯環的打開造成化學降解,形成香豆鹽[15]。上清液降解AFB1實驗中,測定反應結束后的pH為8.2。由李超波[16]實驗表明,pH大于8.5時,才會對AFB1的降解起到較大的影響,由此可以排除pH的干擾。

圖3 Klebsiella sp.XY1菌不同組分對AFB1的降解Fig.3 Result of AFB1degradation by the different components of Klebsiella sp.XY1

2.5 降解曲線的測定

菌株對毒素降解曲線如圖4所示,前12 h內,降解速度較快,而在12～24 h之間降解速度減緩,這是因為在0～12 h內，同時存在活性物質對AFB1的降解作用和菌體對AFB1的吸附作用,但吸附率較低,隨著時間的增加又出現解吸附現象,此時毒素濃度會有所回升,所以降解速度減緩,EI-Nezami等[17]在研究乳酸菌吸附時提出,微生物對毒素的吸附是一個很迅速的過程。在24～120 h內毒素的降解率逐漸提高,可能是由于菌體的解吸附過程徹底結束,只存在活性物質對毒素的降解作用,所以隨著時間的延長,降解率逐漸提高。

圖4 降解曲線Fig.4 Degradation curve

3 結論

從腐爛朽木中分離、篩選出能高效降解AFB1的細菌XY1,其降解率達到71.91%。經鑒定為克雷伯氏菌(Klebsiellasp)。克雷伯氏菌XY1去毒活性物質主要存在于上清液,為胞外代謝產物。本研究結果表明,利用和AFB1的結構類似物香豆素為唯一碳源和能源進行黃曲霉毒素B1降解菌株的篩選,是一種可行、安全的方法。