異淀粉酶產生菌的分離鑒定 及異淀粉酶基因的克隆表達

趙淑琴

(甘肅農業大學基礎實驗教學中心,甘肅蘭州 730070)

異淀粉酶(E.C.3.2.1.33,Isoamylase)是一種內切型淀粉酶,僅專一性作用于支鏈淀粉分支點的α-1,6-糖苷鍵,使其形成直鏈淀粉,而對直鏈淀粉分子中的α-1,6-糖苷鍵不起作用,這種特性最早在淀粉結構的理論研究中應用[1]。到七十年代,異淀粉酶的應用越來越廣泛,逐步從實驗室研究向工業化應用發展,已擴展到淀粉糖漿,啤酒和酒精生產等多個淀粉深加工領域[2]。主要原因是在淀粉加工過程中,異淀粉酶和糖化酶的協同作用可以加速糖化過程,并提高糖化率,和β-淀粉酶配合使用能極大提高麥芽糖得率[3-4]。由于異淀粉酶可以將最小單位的支鏈分解,最大限度地利用淀粉原料,因此是一種需求量很大的支鏈淀粉酶[5-7]。目前除了較成功地應用于高葡萄糖漿,高麥芽糖漿,低聚寡糖和啤酒生產,在醫藥領域亦有應用。

自然界中,異淀粉酶來源廣泛。目前已在大米、甜玉米、馬鈴薯、蠶豆等許多植物中發現有異淀粉酶[8]。高等動物的肝臟、肌肉中也有類似于異淀粉酶水解α-1,6-糖苷鍵的酶存在,但將這些來源的異淀粉酶應用于高速發展的工業上是遠遠不夠的。微生物來源的異淀粉酶數量龐大,而且根據菌的生長特性可以分離出耐高溫、耐低溫、嗜酸性、嗜堿性等適合于不同工業需求的異淀粉酶,因此近年來,人們越來越多的關注微生物來源的異淀粉酶。

1940年,日本學者首次從酵母細胞提取液中發現異淀粉酶[9],但能滿足工業化生產的菌種還是比較難得[10]。1993年,王武等[11]對短桿菌異淀粉酶產生菌進行誘變,選育,從初始酶活為7 U/mL的出發菌,獲得了搖瓶發酵液中酶活單位最高可達20 U/mL的突變菌株,是至今國內較為優良的產異淀粉酶菌種,但一直未見其后續研究及工業化生產的相關報道。2003年,王弋等[12]誘變中溫地衣芽孢桿菌,其出發菌株的異淀粉酶活性達到3.35 U/mL,誘變后酶活提高到7.37 U/mL。2005年,夏靜等[13]從云南梁河溫泉水樣中分離篩選到1株產異淀粉酶的棲熱菌(Thermus),其產酶的初始酶活達4.14 U/mL。關于如何獲得高產量、高穩定性微生物來源的異淀粉酶方面的報道在國內并不多見[7]。2016年,冉紅艷[14]將嗜熱放線菌的異淀粉酶基因克隆到大腸桿菌里,獲得成功表達,酶活力是18.8 U/mL。國外,1988年,Amemura[15]首先使用鳥槍克隆法克隆并測序了P.amyloderamosa的異淀粉酶編碼基因。1989年,Togoni等[16]完成了來源于一株假單胞菌的異淀粉酶編碼基因的克隆和測序。1999年,Abe J[17]將FlavobacteriumodoratumKU異淀粉酶基因成功表達在大腸桿菌中,酶活力達到85.9 U/mL。2007年,Cho等[18]克隆并鑒定了來自Pectobacteriumcarotovrum亞種carotovorum(Pcc)LY34的異淀粉酶基因,并將其表達在大腸桿菌DH5α中,酶活力為35.5 U/mL。因此,細菌異淀粉酶普遍分泌量較低,常規方法如優化發酵產酶條件、紫外誘變等無法從根本上提高酶活,細菌異淀粉酶基因重組表達是解決這一難題的主要策略之一[19]。本實驗從富含淀粉的土壤中分離篩選目的菌株,通過克隆其異淀粉酶基因,以大腸桿菌為受體細胞,旨在建立細菌異淀粉酶基因的克隆與表達系統,獲得高產量、高穩定性的異淀粉酶,彌補工業上的需求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土壤樣品 學校周邊、奶牛場及校內食堂垃圾附近富含淀粉的土壤;支鏈淀粉 玉米來源,金品化學技術有限公司;TIANamp Bacteria DNA Kit 天根生化科技有限公司;Plus DNA Clean/Extraction Kit 北京艾比根生物技術有限公司;DNA凝膠回收試劑盒 上海生工生物工程技術服務有限公司;Primer star MAX、質粒提取試劑盒、DNA A-Tailing Kit、I型核酸染料Gold View、BamH I和Hind III限制性核酸內切酶 均購于索萊寶生物公司;其他試劑 均為國產分析純。

TG1850-WS高速臺式低溫離心機 盧湘儀離心機儀器有限公司;JY-E型電泳儀 北京君意東方電泳設備有限公司;LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;SW-CJ-系列超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;ZHWY-100B多振幅軌道搖床 鄭州宏朗儀器設備有限公司;BWS-系列恒溫水槽 上海一恒科學儀器有限公司;WFH-203紫外檢測儀 上海青浦滬西儀器廠;ZF-1臺式三用紫外檢測儀 上虞市華宏凈化設備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基 平板分離培養基[20]:支鏈淀粉5.00 g,NaCl 2.52 g,瓊脂粉7.5 g,蛋白胨5.00 g,蒸餾水500 mL,pH自然,121.0 ℃滅菌20 min。

液體發酵培養基:支鏈淀粉5.00 g,KH2PO40.61 g,CaCl20.04 g,(NH4)2SO40.50 g,蛋白胨1.00 g,蒸餾水200 mL,pH自然,121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 樣品的采集 在蘭州周邊奶牛場、校內食堂垃圾附近、下水道、糕點店、面粉廠等地將富含淀粉的土壤刮取20 g,裝入自封袋,并標記時間和地點。

1.2.3 菌株的篩選 平板初篩[21]:稱取10 g樣品,放入錐形瓶中,倒入100 mL無菌水[13],放入恒溫搖床中37 ℃,120 r/min,培養24 h后,用移液槍吸取1 mL并稀釋100倍,從稀釋液中吸取50 μL均勻涂布于平板分離培養基上,置于恒溫培養箱內,37 ℃培養24 h后,挑選有透明圈、圈徑比較大的菌落并標記備用[14-15]。

平板復篩:根據初篩平板上菌落的形狀大小、顏色及是否產淀粉酶的特性,將初篩后的各種菌種分別接種在平板上,于恒溫培養箱內37 ℃培養24 h。挑選透明圈較大的單菌落進行搖瓶復篩。

搖瓶復篩:從復篩平板上挑取單菌落,進行搖瓶復篩,將120 mL液體發酵培養基裝入250 mL錐形瓶中,在恒溫搖床內37 ℃、120 r/min培養72 h。發酵液于8000 r/min,離心10 min后,取上清液測定酶活。

1.2.4 酶活力的測定 淀粉酶酶活力的測定[21]:采用3,5-二硝基水楊酸法測定酶活力(以麥芽糖做標準曲線),測定實驗菌株在OD520 nm的光密度值。酶活力單位定義:在40 ℃、pH6.0條件下,每分鐘從1%的支鏈淀粉中釋放出1 mmol麥芽糖的酶量定義為1個酶活力單位(U)

式中:K為標準曲線斜率;F為樣品溶液反應前的總量,100 mL;S為樣品測試量,S=0.5;T為時間,T=10 min;A為實驗組吸光度;A0為對照組吸光度。

取15 mL具塞試管8支,編號,分別加入粗酶液和1%的支鏈淀粉溶液各0.5 mL,以蒸餾水代替粗酶液的試管做對照。再加入3,5-二硝基水楊酸1.5 mL,搖勻,沸水浴5 min,取出冷卻,用蒸餾水稀釋至10 mL,搖勻后用分光光度計于520 nm波長下比色,記錄吸光值,根據標準曲線進行結果計算,每個樣平行做3份,求平均值。

1.2.5 菌種的鑒定 形態學及生理生化鑒定:通過平板培養和穿刺接種法培養篩選出的菌株,觀察其菌落形態和運動能力,再挑取平板培養的單個菌落,通過革蘭氏染色將其分為革蘭氏陽性菌G+和革蘭氏陰性菌G-;通過孔雀綠芽孢染色后,觀察該菌是否產生芽孢。

菌株主要生理生化研究:篩選出劃線培養24 h后的菌種,然后挑取單菌落,進行細菌的硝酸鹽還原試驗、甲基紅試驗、接觸酶試驗(過氧化氫酶試驗)、檸檬酸鹽試驗、硫化氫試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、氧化酶試驗、精氨酸水解試驗[22]。

分子生物學鑒定:16S rDNA序列分析[23]:將提取的菌株總DNA,經瓊脂糖凝膠電泳檢測后,用16S rDNA通用引物進行PCR擴增。細菌專一性16S rDNA引物由TaKaRa公司合成,其序列為:正向引物(27f):5′-AGTTTGATCCTGGTCAG-3′,反向引物(1492r):5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′;16S rDNA PCR反應體系正向引物2 μL,反向引物2 μL,模板DNA4 μL,Primer star MAX 25 μL,ddH2O 17 μL。擴增過程為:94 ℃,5 min;94 ℃,30 s;55～65 ℃,30 s;72 ℃,2 min;共30個循環;72 ℃延伸10 min。擴增產物4 ℃保存。取擴增產物2 μL,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳條件為:電壓110 V,電泳30～45 min。用上海生工的膠回收試劑盒進行16S rDNA PCR產物純化。經純化后,送與北京天一輝遠公司完成測序。然后在NCBI中進行BIAST同源性比對,分析并構建系統發育進化樹。

gyrB基因序列擴增鑒定:湯際亮等[23]報道,單獨分析16S rDNA序列無法區分解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌這樣親緣關系很近的菌種。因此,采用gyrB序列分析法進一步鑒定。gyrB基因通用引物序列:上游引物:5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGC AYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′,下游引物:5′-AGCAGGATACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCR TCNGTCAT-3′;其中Y、N、R表示兼并堿基,Y表示C或T,N表示A、T、C或G,R表示A或G。

PCR反應條件:96 ℃變性1 min,58 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,共35個循環;72 ℃再延伸7 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后進行膠回收,并送與北京天一輝遠公司進行測序,然后在NCBI中進行BLAST的序列同源性比對進一步分析鑒定。

1.2.6 異淀粉酶基因的克隆

1.2.6.1 引物設計 根據NCBI上的遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)異淀粉酶基因編碼區序列(gb:KC133281.1),使用Oligo 6.57和Primer 5.0設計PCR擴增引物,送至金博研生物科技有限公司進行合成,兩條引物的序列分別為:

LEFT:5′-GATGATGGCAGTTACGGCAG-3′;RIGHT:5′-CATGTCACTAGCTTGTCCGC-3′

1.2.6.2 異淀粉酶基因PCR擴增 菌株LZ-5基因組的提取,按照TIANamp Bacteria DNA Kit說明書提取,擴增反應體系如下:LEFT引物2 μL,RIGHT引物2 μL,模板DNA 4 μL,Primer star MAX 25 μL,ddH2O 17 μL。

擴增條件:熱變性為94 ℃,30 s;退火溫度為62 ℃,30 s;延伸溫度為72 ℃,2 min;循環次數為30個;最后一個循環溫度為72 ℃,10 min。擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.6.3 擴增產物3′末端加A尾 按照Plus DNA Clean/Extraction Kit說明書進行擴增產物膠回收,回收產物利用DNA A-Tailing Kit對淀粉酶基因擴增產物進行3′末端加A尾。反應體系為10×A-Tailing Buffer 5 μL,dNTP Mixture 4 μL,A-Tailing Enzyme 1 μL,異淀粉酶基因擴增產物10 μL,ddH2O 30 μL。反應條件為72 ℃水浴槽中反應20 min,然后靜置冰中2 min,最后4 ℃保存。

1.2.6.4 異淀粉酶基因與載體的A-T連接 將3′末端加了A尾的異淀粉酶基因的擴增片段與pMD-18T載體(3′添加了T尾)連接。反應體系為Solution I 6 μL,pMD-18T載體1 μL,異淀粉酶基因擴增產物5 μL,ddH2O 8 μL。將體系中溶液混合后,17 ℃連接16 h,獲得重組質粒pMD-18T-iam1。

1.2.6.5 重組質粒轉化大腸桿菌E.coliDH5a 取出儲存在-80 ℃冰箱的大腸桿菌E.coliDH5a感受態細胞,放置冰中融化,再加入10 μL重組質粒,輕彈管壁使其混合均勻,置于冰中30 min,然后在42 ℃水浴槽中反應2 min,再置于冰中2 min。在離心管中加入1 mL LB液體培養基(不加氨芐青霉素),37 ℃搖床培養1 h后,5000 r/min離心1 min,棄去部分上清液,保留約100 μL上清液再次懸浮細胞,然后將其用涂布棒涂抹在含X-gal、IPTG和氨芐青霉素的LB平板上,放入培養箱中37 ℃培養12～16 h,形成具有藍色和白色的單個菌落。挑選白色菌落即原核工程菌,置于LB液體培養基,37 ℃,180 r/min搖床培養12～16 h[24]。

1.2.6.6 重組質粒的提取及酶切鑒定 提取的重組質粒用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切。反應體系為10×Loading Buffer 3 mL,BamH Ⅰ 1 μL,Hind Ⅲ 1 μL,重組質粒pMD-18T-iam1 4 μL。然后往體系中加ddH2O至20 μL混勻后,放入37 ℃水浴槽中反應3 h。酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,然后將檢測符合異淀粉酶基因的片段送至金博研生物技術有限公司進行測序。

1.2.7 異淀粉酶基因在大腸桿菌中的表達 由于原核工程菌所產生的異淀粉酶是包涵體,所以將原核工程菌用1.0 mmol/L IPTG 誘導4 h后,用細胞破碎儀對工程菌進行破碎,以未插入重組質粒的大腸桿菌為對照,按照1.2.4酶活力的測定方法測工程菌的異淀粉酶活力[25]。

2 結果與分析

2.1 形態學觀察及生理生化鑒定

采用碘熏法在平板上對異淀粉酶產生菌進行篩選，選出1株產異淀粉酶的菌株LZ-5，結果如圖1所示,測定其酶活力值為10.9 U/mL。通過平板培養后觀察菌株LZ-5為紅色菌落,菌落不透明,有形狀似小傘的皺褶,由中央凸起向周圍擴散,邊緣不整齊;芽孢可見,兩端鈍圓,直徑約0.5 μm,長約2.0 μm。用孔雀綠芽孢染色后,能清晰看到芽孢,結果見圖2。對菌株LZ-5進行生理生化鑒定,實驗結果(表1)表明,菌株LZ-5可發酵多種糖,產酸產氣,能液化明膠,吲哚試驗和檸檬酸鹽試驗為陰性,其他試驗均為陽性。結合形態學觀察,初步推斷該菌屬于芽孢桿菌科。與文獻報道[23]解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌的生理生化特性非常相近。

圖1 菌株LZ-5的水解圈(A)及菌落形態(B)Fig.1 The transparent circle of strain LZ-5 after iodine staining(A)and the colonial morphology(B)

圖2 菌株LZ-5革蘭氏染色形態(A) 及孔雀綠芽孢染色形態(B)(10×100)Fig.2 Morphology of strain LZ-5 after gram staining(A) and after malachite green spore staining(B)(10×100)

表1 菌株 LZ-5的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain LZ-5

2.2 分子生物學鑒定結果

2.2.1 菌株LZ-5的16S rDNA序列分析 菌株LZ-5經16S rDNA通用引物PCR擴增后,用瓊脂糖凝膠電泳檢測,結果如圖3所示,將電泳后的條帶進行膠回收后進行PCR擴增,再進行瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。將PCR擴增后的產物送與北京天一輝遠公司進行測序,根據測得的序列在NCBI中進行BLAST比對,LZ-5菌株與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、甲基營養型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)等的16S rDNA都具有高度相似性,相似度都為99%,序列比對(圖4)分析它們都處于同一分支,所以通過16S rDNA不能確定該菌。

圖3 LZ-5菌的16S rDNA序列PCR擴增結果 Fig.3 PCR amplification results of 16s rDNA sequence of strain LZ-5

圖4 菌株LZ-5的16S rDNA序列比對Fig.4 The 16S rDNA sequence alignment of strain LZ-5

2.2.2 菌株的gyrB基因序列分析 菌株 LZ-5經gyrB基因序列擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳,將電泳后的產物進行膠回收,并送與北京天一輝遠公司進行測序,測序的結果:

在NCBI中進行BLAST序列比對分析,結果發現其與枯草芽孢桿菌的gyrB基因具有99%的同源性，因此鑒定菌株LZ-5為枯草芽孢桿菌。

2.3 異淀粉酶基因的PCR擴增

以枯草芽孢桿菌基因組DNA為模板,LEFT和RIGHT為引物,退火溫度為62 ℃,進行擴增。擴增產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。由圖5可知,擴增出的異淀粉酶基因片段大小約2000 bp。

圖5 異淀粉酶基因的PCR擴增Fig.5 PCR amplification of isoamylase gene注： M:DNA Marker;1:異淀粉酶基因。

2.4 重組質粒的篩選

將重組質粒導入大腸桿菌E.coliDH5a感受態細胞,然后37 ℃搖床培養1 h,留約100 μL上清液重新懸浮細胞并涂抹在含X-gal、IPTG和氨芐青霉素的LB平板上,經37 ℃恒溫培養12～16 h后,形成具有藍色和白色的單個菌落。由圖6可知,重組質粒成功導入了大腸桿菌。

圖6 藍白斑篩選Fig.6 White-blue plaque selection

2.5 重組質粒鑒定

挑選白色菌落,置于LB液體培養基(含氨芐青霉素),培養12～16 h,然后將提取的重組質粒進行酶切,酶切產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。由圖7可知,酶切下來的基因片段大小為2000 bp,與圖5中PCR擴增出的異淀粉酶基因大小接近。重組質粒的酶切小片段回收后,送至金唯智生物技術有限公司進行測序。測序結果表明:異淀粉酶基因全長1980 bp,通過軟件MEGA5.1上的Clustal W與NCBI上報道的遲緩芽孢桿菌異淀粉酶基因進行比對,相似度為96%,表明已成功克隆出了異淀粉酶基因。

圖7 質粒pMD-18T-iam1載體酶切鑒定的電泳結果Fig.7 Restriction fragment analysis of vector pMD-18T-iam1注：M:DNA Marker；1:環狀質粒；2:線性質粒； 3:重組質粒酶切產物；4:異淀粉酶基因。

2.6 原核工程菌產異淀粉酶的酶活性

將原核工程菌用1.0 mmol/L IPTG誘導4 h后,用細胞破碎儀對工程菌進行破碎,以未插入重組質粒的大腸桿菌為對照,按照1.2.4的異淀粉酶酶活力測定方法,測得異淀粉酶酶活力為28.4 U/mL,是原菌的2.6倍。

3 結論

本實驗從富含淀粉的土壤中篩選出1株高產異淀粉酶的菌株LZ-5,通過菌落形態觀察、生理生化特性實驗、16S rDNA序列及gyrB基因分析,構建系統發育進化樹對其進行鑒定,結果表明菌株LZ-5為枯草芽胞桿菌,根據NCBI上的遲緩芽孢桿菌異淀粉酶基因設計引物,通過聚合酶鏈式反應(PCR)獲得該菌株的異淀粉酶基因的序列,構建pMD-18T-iam1載體,導入到E.coliDH5a感受態細胞,經IPTG 誘導表達,構建的大腸桿菌工程菌,通過細胞破碎儀破碎后,測得異淀粉酶酶活力為28.4 U/mL,是菌株LZ-5的2.6倍。在本研究基礎上,下一步探索把該異淀粉酶基因采用合適的載體導入出發菌株枯草芽孢桿菌中,實現同源表達,利用該菌株天然的、優良的分泌表達系統,實現突變異淀粉酶基因更高效的表達。