響應面法優化橄欖果渣羥基酪醇提取工藝

王 強,黃梅桂,謝躍杰,3,趙富昌,任彥榮,3,王 波,任貴禮

(1.重慶第二師范學院生物與化學工程學院,重慶 400067; 2.南京林業大學輕工與食品學院,江蘇南京 210037; 3.重慶第二師范學院脂質資源與兒童日化品協同創新中心,重慶 400067; 4.重慶江源油橄欖開發有限公司,重慶 404100; 5.甘肅出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術中心,甘肅蘭州 737100)

油橄欖(OleaeuropaeaL.)屬木犀科、木犀欖屬常綠喬木,是世界著名的木本油料樹種,有4000多年的栽培歷史。以油橄欖果實榨取的橄欖油富含不飽和脂肪酸、酚類物質和脂溶性維生素等多種活性成分,具有多重保健功效[1-2]。近年來,橄欖的主要用途是生產初榨橄欖油,在橄欖油加工過程中,油橄欖鮮果經磨漿、離心分離制取初榨橄欖油后,產生大量的果渣,果渣中含有果渣油、多酚和萜類化合物等多種活性成分[2],其中酚類物質中的橄欖苦苷含量占25%,橄欖苦苷的性質不穩定,在酸、堿和酶的作用下易降解為羥基酪醇和欖香酸[3]。有研究報道，羥基酪醇具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗血栓、抗菌、抗病毒等功能[4-7],尤其是其抗氧化活性高,被稱為是最具清除自由基能力的天然抗氧化劑之一,其對自由基清除率是槲皮素的2倍[8-9]。此外,大多數橄欖油生產企業將橄欖果渣直接丟棄或作堆肥及飼料,果渣中有效成分未充分開發與利用。橄欖果渣中有機物含量高,致使化學需氧量(COD)和生物需氧量(BOD5)較高[1],隨雨水或其他方式進入土壤或湖水,影響水體或土壤的污染物承載能力,長期堆放使得周圍蠅蟲飛舞、臭氣熏天,造成了資源浪費和環境污染。

目前,超聲輔助提取法與振蕩水浴法是最常用的兩種前處理提取方法[10],盡管有研究將兩種方法用于橄欖果渣中羥基酪醇的提取,但此前的研究對橄欖果渣中羥基酪醇提取率無法達到滿意的效果。本文分別討論超聲輔助水解與振蕩水浴水解兩種提取工藝中的各因素對橄欖果渣中羥基酪醇的提取效果,并進行對比,得出較優的提取工藝,進而通過Box-Behnken響應面設計進行優化,以期找到適合橄欖果渣中羥基酪醇的提取工藝,從而提高羥基酪醇的提取率,為橄欖果渣中有效成分的開發利用提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油橄欖果渣 重慶江源油橄欖開發有限公司,羥基酪醇 純度>98%,中國標準物質中心,北京世紀奧科生物技術有限公司;乙腈、甲醇 色譜純,德國Merck公司;其余試劑 如無特殊說明均為分析純。

UPLC超高效液相色譜儀、二極管陣列檢測器(ACQUITY UPLC) 美國Waters公司;電子天平(±0.01 g) 常熟雙杰測試儀器廠;BL610分析天平(0.1 mg) 德國Sartorius公司;SIGMA-K615冷凍離心機 德國SIGMA公司;IKA MS3渦旋儀 德國IKA公司;Thermo Electron移液槍(100～1000、20～100 μL) 美國Thermo公司;DKZ-3恒溫水浴振蕩器 上海一恒科技有限公司;Elmasonic S 300 H超聲儀 德國 Elma 公司;4001型旋轉蒸發儀 德國Heidolph公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱:BEH C18(50 mm×1.0 mm,1.7 μm);流動相:A為0.1%(v/v)甲酸乙腈,B為0.1%(v/v)甲酸水;流速0.1 mL/min;進樣量:2.0 μL;柱溫35 ℃;檢測波長為280 nm;梯度洗脫:流動相A初始為5%,0.0～5.0 min流動相A比例由5%變為10%,5.0～8.0 min流動相A由10%變為70%,8.0～9.0 min流動相A比例回到5%,平衡2.0 min。

1.2.2 標準品溶液的制備 稱取羥基酪醇標準品適量,用0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液溶解并定容至100 mL,配制成含羥基酪醇為203.4 mg/L的標準儲備液,4 ℃下冷藏待用。標準工作液:分別準確移取10、5、2.5、0.63、0.16、0.063 mL標準貯備液至10 mL容量瓶中,0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液準確定容,配制成相應的標準工作液,4 ℃下冷藏待用。

1.2.3 樣品處理

1.2.3.1 超聲波輔助鹽酸水解提取橄欖果渣中羥基酪醇 超聲波輔助鹽酸水解提取橄欖果渣中羥基酪醇參見李春燕等[10]的方法,并作一定修改:稱取1.0 g橄欖果渣放入50 mL聚乙烯管中,加入一定量的鹽酸溶液,置于適當溫度的超聲裝置(超聲功率1400 w)中,超聲反應一定時間后取出,用2 mol/L氫氧化鈉溶液中和至中性,并將水解液定容,經0.22 μm 微孔濾膜后,UPLC檢測。

1.2.3.2 振蕩水浴鹽酸水解提取橄欖果渣中羥基酪醇 稱取1.0 g橄欖果渣置于50 mL聚乙烯管中,加入一定量的鹽酸溶液,置于適當溫度的水浴振蕩器中,振蕩頻率100 r/min,反應一定時間后取出,用2 mol/L氫氧化鈉溶液中和至中性,并將水解液定容,經過0.22 μm微孔濾膜后,UPLC檢測。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 超聲輔助鹽酸水解法 鹽酸濃度對羥基酪醇提取量的影響 設定料液比為1∶20 g/mL、提取溫度為40 ℃、超聲時間為30 min,考察鹽酸溶液濃度為0.02、0.05、0.2、0.5、1.0 mol/L時,對橄欖果渣中羥基酪醇提取量的影響。

超聲時間對羥基酪醇提取量的影響:設定料液比為1∶20 g/mL,提取溫度40 ℃,鹽酸溶液濃度為0.5 mol/L,考察超聲時間為15、30、45、60、80、100、120 min時,對橄欖果渣中羥基酪醇提取量的影響。

料液比對羥基酪醇提取量的影響:設定提取溫度為40 ℃,超聲時間為60 min,鹽酸濃度為0.5 mol/L,考察料液比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30 g/mL時,對橄欖果渣中羥基酪醇提取量的影響。

提取溫度對羥基酪醇提取量的影響:設定超聲時間為60 min,鹽酸濃度為0.5 mol/L,料液比為1∶20 g/mL,考察提取溫度為40、60、80、90、100 ℃時,對橄欖果渣中羥基酪醇提取量的影響。

1.2.4.2 振蕩水浴鹽酸水解法 提取溫度對羥基酪醇提取量的影響 設定鹽酸溶液濃度為0.2 mol/L,料液比為1∶15 g/mL,水解時間30 min,考察提取溫度為40、60、80、90、100 ℃時,對橄欖果渣中羥基酪醇提取量的影響。

鹽酸濃度對羥基酪醇提取量的影響:設定料液比為1∶15 g/mL,水解時間30 min,提取溫度為90 ℃,考察鹽酸溶液濃度為0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mol/L時,對橄欖果渣中羥基酪醇提取量的影響。

料液比對羥基酪醇提取量的影響:設定水解時間為30 min,鹽酸溶液濃度為1.5 mol/L,提取溫度為90 ℃,考察料液比為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL時,對橄欖果渣中羥基酪醇提取量的影響。

水解時間對羥基酪醇提取量的影響:設定鹽酸溶液濃度為1.5 mol/L,提取溫度為90 ℃,料液比為1∶30 g/mL,考察水解時間為30、60、120、180、240 min時,對橄欖果渣中羥基酪醇提取量的影響。

1.2.5 對比試驗 將上述2種酸解方式中單因素的最佳條件進行對比試驗,找出水解提取羥基酪醇含量最高的水解方法。

1.2.6 響應面試驗設計 在對比試驗結果的基礎上,選取最佳酸解方式,并且選取鹽酸濃度、料液比、提取溫度、水解時間作為影響因素,根據Box-Behnken實驗設計原理,響應面分析實驗為四因素三水平共29個點,這些實驗點分為兩類:一類是自變量取值在各水平所構成的三維析因點,共24個;一類是區域的中心點,零點實驗重復5次,用來估計實驗誤差。響應面實驗的因素與水平見表1。

表1 響應面實驗因素與水平Table 1 Experimental factors and levels of response surface

1.2.7 羥基酪醇提取量的計算 計算方法如下所示:

羥基酪醇提取量(mg/g)=提取液中羥基酪醇的質量(mg)/稱取的橄欖果渣的質量(g)。

1.3 數據處理

利用Design-Expert 8.0.6軟件進行實驗設計和分析。實驗數據以平均數±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 線性范圍和最低檢出限 分別準確移取標準工作液按“1.2.1”色譜條件進行測定,以峰面積Y為縱坐標,濃度X為橫坐標進行線性回歸,得到回歸方程:Y=5962.8X-18124,r=0.9991,結果表明羥基酪醇在1.28～203.40μg/g的范圍內線性關系良好,能滿足對橄欖果渣中羥基酪醇提取量的檢測要求。當信噪比(S/N)為3和10時,該方法的最低檢出限為0.22 μg/g,定量限為0.67 μg/g。

2.1.2 加標回收率和精密度 在混勻的橄欖果渣樣品中添加高(50 μg/g)、中(25 μg/g)、低(5 μg/g)濃度的羥基酪醇標準溶液,渦旋2.0 min后靜置10 min,按“2.5.4”最佳優化的實驗條件處理樣品,“1.2.1”色譜條件進樣測定,以濃度值計算加標回收率。每一添加濃度樣品重復測定6次來計算其精密度。結果顯示,加標回收率在81.73%～104.09%之間,相對標準偏差(RSD)在3.7%～4.9%之間。

2.1.3 穩定性實驗 取橄欖果渣樣品,按照“2.5.4”最佳優化的實驗條件處理樣品,“1.2.1”所述色譜條件分析,在室溫條件下,分別經0、4、12、24、48、72 h進樣分析可知,橄欖果渣中羥基酪醇在12 h后開始降解,在48 h內降解超過23.56%,故樣品處理完成后需在12 h內進行分析。

2.1.4 重復性實驗 準確稱取混勻的橄欖果渣樣品6份,按“2.5.4”最佳優化的實驗條件處理樣品,“1.2.1”所述的色譜條件進樣分析,通過計算提取的羥基酪醇含量及RSD,可以看出,6份同一橄欖果渣樣品中羥基酪醇提取量的RSD分別為1.94%和3.07%，表明方法重復性較好。

2.2 超聲輔助水解提取橄欖果渣中羥基酪醇單因素實驗

2.2.1 鹽酸濃度對羥基酪醇提取量的影響 不同鹽酸濃度對羥基酪醇提取量的影響結果見圖1A。由圖1A可知,羥基酪醇提取量隨著鹽酸濃度的增加而增加,當鹽酸濃度達到0.5 mol/L時,羥基酪醇提取量趨于平穩,說明此時橄欖果渣中的橄欖苦苷已水解完全[11],故試驗選擇鹽酸濃度為0.5 mol/L。

2.2.2 超聲時間對羥基酪醇提取量的影響 不同超聲時間對羥基酪醇提取量的影響結果見圖1B。由圖1B可知,超聲時間為60 min時,羥基酪醇提取量達到最高,超聲60 min后,其提取量有所下降,主要原因是，橄欖果渣在長時間水解的過程中導致部分羥基酪醇被氧化[11],因此,試驗選水解時間為60 min。

2.2.3 料液比對羥基酪醇提取量的影響 不同料液比對羥基酪醇提取量的影響結果見圖1C。由圖1C可知,羥基酪醇提取量隨著料液比的增加呈先上升后下降趨勢,因為適當的料液比可以提高羥基酪醇的溶出率,料液比過小,溶劑量少，導致物料的黏度大,羥基酪醇的擴散速度慢會阻止其的有效溶出,提取不完全,提取量較低,隨著料液比的增加,羥基酪醇提取量先呈上升趨勢，而當料液比達到1∶20 g/mL時,羥基酪醇提取量最高,幾乎所有的羥基酪醇已經全部溶出,再增加溶劑的量會使這種擴散平衡被打破,提取量下降。考慮到提升羥基酪醇的提取量和盡量減少用水的情況下[3],選取料液比為1∶20 g/mL。

2.2.4 提取溫度對羥基酪醇提取量的影響 不同提取溫度對羥基酪醇提取量的影響結果見圖1D。從圖1D可知,提取溫度越高,羥基酪醇提取量越高,過低的提取溫度不利于最大限度地提取羥基酪醇[3]。但當提取溫度達到80 ℃時,羥基酪醇提取量基本趨于平穩,說明在此條件下就水解完全。因此選擇提取溫度為80 ℃。

圖1 鹽酸濃度、水解時間、料液比和提取溫度對羥基酪醇含量的影響Fig.1 Effect of hydrochloric acid concentration,time,solid-liquid ratio and temperature on the hydroxytyrosol extraction content

2.3 振蕩水浴提取橄欖果渣中羥基酪醇單因素實驗

2.3.1 提取溫度對羥基酪醇提取量的影響 不同提取溫度對羥基酪醇提取量的影響結果見圖2A。由圖2A可知,提取溫度越高,羥基酪醇提取量越高,當提取溫度達到90 ℃時,羥基酪醇提取量基本趨于平穩,說明羥基酪醇在此條件下就可水解完全[3]。因此選擇提取溫度為90 ℃。

圖2 水解時間對羥基酪醇含量的影響Fig.2 Effect of hydrolysis temperature,hydrochloric acid concentration, solid-liquid ratio and time on the hydroxytyrosol extraction content

2.3.2 鹽酸濃度對羥基酪醇提取量的影響 不同鹽酸濃度對羥基酪醇提取量的影響結果見圖2B。從圖2B可以看出,羥基酪醇提取量隨著鹽酸濃度的增加而逐漸增大,當濃度增加至1.5 mol/L時,羥基酪醇提取量達到最高,隨著鹽酸濃度的進一步增加,羥基酪醇提取量逐漸減少,說明此時橄欖果渣中的橄欖苦苷已水解完全[11],故試驗選擇鹽酸濃度為1.5 mol/L。

2.3.3 料液比對羥基酪醇提取量的影響 不同料液比對羥基酪醇提取量的影響結果見圖2C。由圖2C可知,羥基酪醇提取量隨著料液比的增加先上升后下降再趨于平穩,當料液比達到1∶30 g/mL時,羥基酪醇提取量最高。因此,選擇料液比為1∶30 g/mL。

2.3.4 水解時間對羥基酪醇提取量的影響 不同水解時間對羥基酪醇提取量的影響結果見圖2D。由圖2D可知,羥基酪醇提取量在60 min時達到最高,60 min以后提取量有所下降,時間越長,導致橄欖苦苷分解,羥基酪醇提取量減少[12],因此,選擇水解時間為60 min。

2.4 超聲輔助水解與振蕩水浴水解提取橄欖果渣中羥基酪醇對比實驗

針對2種水解工藝的單因素試驗,選取超聲輔助水解工藝參數:鹽酸濃度為0.5 mol/L,超聲時間為60 min,提取溫度為80 ℃,料液比為1∶20 g/mL;振蕩水浴水解工藝參數:提取溫度為90 ℃,鹽酸濃度為1.5 mol/L,料液比為1∶30 g/mL,水解時間為60 min,分別平行制備6份樣品,考察方法的重現性,結果顯示2種水解工藝重現性均較好,RSD均小于2%。其中,振蕩水浴水解工藝所得的羥基酪醇提取量為(1.51±0.23) mg/g,超聲輔助水解工藝所得的羥基酪醇提取量為(0.84±0.11) mg/g,可知,振蕩水浴水解工藝所得的羥基酪醇提取量約為超聲輔助水解工藝的2倍,基于此,試驗擬采用響應面法對振蕩水浴水解提取羥基酪醇工藝進行優化。

2.5 響應面試驗結果

2.5.1 響應面試驗設計及結果 見表3。

表3 響應面法試驗設計與結果Table 3 Experimental results and analysis of response surface method

2.5.2 響應面曲面方差分析 運用Design Expert 8.0.6軟件對表3數據進行統計分析,可得出四因素與羥基酪醇提取量之間的多元二次方程關系式:羥基酪醇提取量Y=3.00-0.034A-9.167E-003B+0.20C+0.17D-0.13AB+0.21AC-0.27AD-0.34BC-0.34BD-0.10CD-0.47A2-0.089B2-0.19C2-0.092D2。

由表4方差分析可知,本實驗擬合的模型p<0.0001,表明響應回歸模型極顯著,決定系數R2=0.9209,表明92.09%的數據可以用此方程來解釋,該模型與實際數據相關性較好;失擬項p=0.07987>0.05不顯著,說明回歸方程與實際擬合性好,因此,此擬合模型適用于對振蕩水浴鹽酸水解橄欖果渣中羥基酪醇的提取量進行分析和預測。通過該模型的方差分析可知:料液比(C)、水解時間(D)對羥基酪醇提取量的影響差異均顯著(p<0.05),而提取溫度(A)、鹽酸濃度(B)對羥基酪醇提取量的影響差異不顯著(p>0.05)。這四個因素對橄欖果渣中羥基酪醇提取量的影響效應大小依次為料液比(C)>水解時間(D)>提取溫度(B)>鹽酸濃度(A)。

表4 方差分析Table 4 Variance analysis

2.5.3 兩因素交互作用的響應曲面分析 吸附率對應于提取溫度、鹽酸濃度、料液比、水解時間所形成的三維空間曲面,可直接形象地反映各因素及其之間的交互作用對羥基酪醇提取量的影響。

運用Design Expert 8.0.6軟件分析得到的響應曲面如下圖3所示。由圖3可以看出,(b)、(d)、(e)呈現的是曲面較陡峭的曲線,說明提取溫度與料液比、溫度與水解時間、鹽酸濃度與料液比、鹽酸濃度與水解時間的交互作用對羥基酪醇提取量的影響較大,而溫度與鹽酸濃度、料液比與水解時間的交互作用曲面更平緩,說明它們的交互作用對羥基酪醇提取量的影響較小,這與上表中的交互作用結果的趨勢也是一致的。

圖3 兩因素交互影響吸附率響應曲面圖Fig.3 Response surface plot

2.5.4 回歸方程及驗證實驗 借助Design Expert 8.0.6軟件中多元二次回歸模型對羥基酪醇提取量進行估算,對二次函數模型進行極值分析,預測四因素的最佳組合為:提取溫度(A)87.8 ℃、鹽酸濃度(B)1.14 mol/L、料液比(C)1∶35.8 g/mL、水解時間(D)86.4 min,此時模型預測羥基酪醇提取量極大值為3.39 mg/g。考慮到實際操作的便利,在預測的最佳優化條件的基礎上將工藝參數修正為提取溫度88 ℃、鹽酸濃度1.2 mol/L、料液比1∶36 g/mL、水解時間86 min,并驗證實驗,平行制備6份樣品進行測定,實測羥基酪醇提取量為(3.38±0.12) mg/g,與預測值無明顯差異。

3 結論

本研究建立了分離檢測橄欖果渣中羥基酪醇的超高效液相色譜方法,其在1.28～203.40 μg/g范圍內線性關系良好,方法的重現性、穩定性、精密度均達到要求。同時,分別討論了超聲輔助酸解與振蕩水浴鹽酸酸解提取橄欖果渣中羥基酪醇的單因素條件,再進行實驗對比,發現振蕩水浴鹽酸水解工藝所得羥基酪醇的提取量約為超聲輔助水解工藝的2倍。在振蕩水浴水解單因素的基礎上,對其工藝條件進行響應面優化,最終確定最優的水解工藝條件為提取溫度88 ℃、鹽酸濃度1.2 mol/L、料液比1∶36 g/mL、水解時間86 min,優化工藝后得到橄欖果渣中羥基酪醇的提取量為(3.38±0.12) mg/g。通過驗證實驗說明所建立的模型可以很好的應用于實踐,為橄欖果渣中羥基酪醇的提取開發利用提供可靠的技術支持。