響應面法優化卡布里鷹嘴豆蛋白提取工藝

張俊杰,郭 晨,劉毅飛,方 彩,王志偉,王義虬,縱 偉,2,*

(1.鄭州輕工業學院食品與生物工程學院,河南鄭州 450002; 2.食品生產與安全河南省協同創新中心,河南鄭州 450002; 3.河南省冷鏈食品質量安全控制重點實驗室,河南鄭州 450002)

鷹嘴豆(CiceraritienumL.)是豆科(Leguminosae)鷹嘴豆屬(Cicer)唯一栽培種[1],世界第二大種植豆類,僅次于大豆[2],也是世界第三大作為膳食蛋白質來源的豆類作物[3],已經有幾千年的栽培歷史[4]。鷹嘴豆是一種天然植物蛋白資源,蛋白質含量占籽粒干基總量的13%～33%[5],貯藏蛋白主要由清蛋白、球蛋白和谷蛋白組成[6]。鷹嘴豆含有18種氨基酸,包括人體必需的8種氨基酸[7]。鷹嘴豆蛋白因其氨基酸組成均衡、生物利用率高和抗營養因子低而被作為植物蛋白的重要來源[8],且鷹嘴豆蛋白本身就具有一定的抗氧化活性[9],是一種非常好的全價蛋白[10]。

卡布里鷹嘴豆的傳統種植區是在地中海沿岸和中亞地區[11]。我國鷹嘴豆主要分布于新疆、青海、甘肅和云南等省[12],其中,新疆的木壘縣和奇臺縣是我國鷹嘴豆的主產區[13]。該地區根瘤菌的遺傳多樣性已被充分研究。根瘤菌可以與鷹嘴豆共生固氮,進一步影響鷹嘴豆籽粒品質,如蛋白質含量等。而云南文山地區是首次引種卡布里鷹嘴豆,對其籽粒中蛋白尚未見相關研究報道。

綜合國內外對于蛋白質提取的研究,普遍采用的方法有溶液提取法、酶提取法、超聲波提取法和雙水相萃取法[14]。堿溶酸沉法是溶液提取法的一種,主要是利用蛋白質在等電點(Isoelectric point,pI)溶解度最小的原理,在pH較高時溶解蛋白,然后調節pH至pI使之凝聚沉淀[15]。該法具有操作簡單、易于控制、成本低廉等優點[16]。之前周麗卿等[17]以新疆鷹嘴豆為原料探究了其蛋白質的最佳提取工藝參數,但尚未對其蛋白純度進行研究。

本文以云南文山卡布里鷹嘴豆為原料,采用堿溶酸沉法提取鷹嘴豆蛋白,并進一步優化了蛋白提取工藝,同時保證了高蛋白得率與高蛋白純度,旨在為云南地區鷹嘴豆的推廣種植與綜合利用提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

卡布里鷹嘴豆 云南文山自治州丘北縣;氫氧化鈉、鹽酸、濃硫酸、硼酸、溴甲酚綠、甲基紅、石油醚(沸程60～90 ℃) 分析純,天津市永大化學試劑有限公司。

400Y粉碎機 浙江金華鉑歐五金廠;TGL-20M臺式高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司;AE224電子分析天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;250 mL索氏抽提器 鄭州中天實驗儀器有限公司;101-2電熱鼓風干燥箱 北京中興偉業儀器有限公司;T6新世紀紫外可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;HYP-3智能消化爐、KDN-103F型自動定氮儀 上海纖檢儀器有限公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 粉碎 選擇成熟且顆粒飽滿的鷹嘴豆籽粒,用粉碎機以30000 r/min的轉速粉碎,過100目篩。將過篩的豆粉放入烘箱中，40 ℃烘干至恒重,裝入自封袋4 ℃保存備用。

1.2.2 脫脂 索氏抽提參照國家標準GB/T 5009.6-2003[18]。將干燥至恒重的豆粉用濾紙包好放入索氏抽提器中,以沸程為60～90 ℃的石油醚為提取劑進行脫脂。抽提溫度80 ℃,抽提時間8 h,至抽提器中石油醚由黃色變為透明無色,以保證脫脂完全。脫脂后的豆粉放于烘箱中，40 ℃進行干燥至恒重,裝入自封袋4 ℃保存備用。

1.2.3 等電點的測定 Sanchez-Vioque等[19]測定了鷹嘴豆總蛋白的等電點為4.3,初步判斷云南卡布里鷹嘴豆的等電點主要在4～5之間。采用紫外分光光度法測定。稱取0.5 g脫脂豆粉9份,制備堿溶上清液10 mL,用5 mol/L HCl溶液調節pH分別為3.5、4.0、4.1、4.3、4.5、4.7、4.9、5.0、5.5,6000 r/min 離心15 min,分別吸取1 mL上清液,在595 nm處比色測定吸光值[20]。上清液吸光度最低,即殘留蛋白最少,所對應的pH為蛋白的等電點。

1.2.4 卡布里鷹嘴豆蛋白的提取 用文獻[21]中報道的方法并做適當修改,從云南卡布里鷹嘴豆中提取蛋白。稱取脫脂后的豆粉3 g置于錐形瓶中,分別編號,按照一定比例加入蒸餾水,搖勻后滴加0.5 mol/L的NaOH溶液調節pH,攪拌溶解一定時間后,將溶液轉移到離心管中進行離心,在6000 r/min的轉速下離心15 min。離心完畢,取上清液傾倒于前一步的錐形瓶中。然后用0.5 mol/L HCl溶液調節上清液pH至鷹嘴豆蛋白等電點4.9,繼續在6000 r/min的轉速下離心15 min。之后將上清液傾倒干凈,所得沉淀物即為云南卡布里鷹嘴豆蛋白粗提物。

1.2.5 單因素實驗 按照上述步驟,以提取鷹嘴豆蛋白的液料比、堿溶pH、堿溶溫度、堿溶時間為試驗因素,以鷹嘴豆粗蛋白得率作為試驗指標,分別做單因素實驗,以分析各因素對鷹嘴豆蛋白得率的影響。

以液料比為單因素時,在堿溶溫度40 ℃,堿溶時間30 min,堿溶pH9.5,酸沉pH4.9的條件下,將液料比梯度分別設置為8∶1、10∶1、12∶1、14∶1和16∶1 mL/g提取蛋白質。

以堿溶pH為單因素時,在液料比12∶1 mL/g,堿溶溫度40 ℃,堿溶時間30 min,酸沉pH4.9的條件下,將堿溶pH梯度設置為8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5和11.0提取蛋白質。

以堿溶溫度為單因素時,在液料比12∶1 mL/g,堿溶pH9.5,堿溶時間30 min,酸沉pH4.9的條件下,將堿溶溫度梯度設置為20、30、40、50、60 ℃提取蛋白質。

以堿溶時間為單因素時,在液料比12∶1 mL/g,堿溶pH9.5,堿溶溫度40 ℃,酸沉pH4.9的條件下,將堿溶時間梯度設置為30、60、90、120、150 min提取蛋白質。

1.2.6 響應面試驗 在單因素實驗的基礎上,選取堿溶pH、液料比和堿溶時間三個因素,每個因素中選取三個對蛋白質得率影響較大的水平,建立三因素三水平的Box-Behnken中心組合試驗,以蛋白質得率為響應值,各因素的三個水平采用-1、0、1進行編碼,如表1。每個試驗組合重復測定2次,取其平均值作為得率結果,試驗結果采用Design-Expert 8.0.6.1軟件分析。

表1 Box-Behnken 實驗設計因素及水平表Table 1 Variables and levels for Box-Behnken design

1.2.7 計算公式 對采用堿溶酸沉法最終產物蛋白質得率按照以下公式計算。

蛋白質得率(%)=提取出粗蛋白質的質量/脫脂豆粉的質量×100

鷹嘴豆粉純度測定按照國家標準GB5009.5-2016[22]計算,采用凱氏定氮法進行,氮含量換算蛋白質含量的換算系數:6.25。計算公式如下:

純度(%)(干基)=[(V2-V1)×(N×0.0140×K×100)]/[W×(100-X)×100]

式中:V2-滴定試樣時消耗酸標準溶液的體積(mL);V1-滴定試樣時消耗酸標準溶液的體積(mL);N-酸標準溶液的當量濃度,N;K-氮換算成粗蛋白質的系數;W-試樣質量(g);X-試樣水分含量;0.0140-每毫克當量氮的克數。

1.2.8 數據處理 利用OriginPro 9.0、Design-Expert 8.0.6 Trial和SPSS Statistics 17.0.0.236進行數據處理及分析。

2 結果與分析

2.1 鷹嘴豆脫脂蛋白等電點測定結果

從圖1可以看出,在所測的pH范圍內,隨著pH的增大,上清液的吸光度呈現出先減小后增大的趨勢。在pH為4.9處,上清液的吸光度最小,表明了上清液中所殘留的蛋白質濃度最低,該pH即為鷹嘴豆蛋白質的等電點。與張濤等[23]報道的鷹嘴豆分離蛋白等電點pI=5相似。

圖1 吸光度隨pH變化曲線Fig.1 Absorbency with pH change curves

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 液料比對鷹嘴豆蛋白質得率的影響 由圖2可得,蛋白質得率基本在10.50%左右,并隨著加水量的增加先增大,在液料比為12∶1 mL/g時得率為最大,達到10.69%,之后得率逐漸減小。這是由于適當增加液料比有助于增加蛋白質的溶出量,提高得率;但液料比過大,蛋白質分子與水分子之間相互作用增加,使蛋白質分子之間不容易發生聚沉,在酸沉時會導致蛋白質流失到上清液中,反而造成蛋白質損失[20],從而降低得率。綜合考慮,提取鷹嘴豆蛋白質的最佳液料比為12∶1 mL/g。

圖2 液料比對鷹嘴豆蛋白質得率的影響Fig.2 Effect of ratio of water to material on the yield of Chickpea protein

2.2.2 堿溶pH對鷹嘴豆蛋白質得率的影響 由圖3可見,隨著pH的升高,蛋白質得率逐漸提高,由10.34%一直上升到了12.48%,在堿溶pH為10時達到峰值。但堿溶pH大于10時,蛋白質得率急劇下降,這符合一般植物蛋白在不同pH下的溶解規律。隨著堿溶pH的升高,有利于蛋白質在堿性條件下溶解,從而得率升高;但是過高的pH會使蛋白質對水的親和性增加,從而一部分非水溶性蛋白轉變為水溶性蛋白,同時,過高的pH改變了蛋白質分子表面的帶電荷狀況,引起脫羧、脫氨、胱賴反應、肽鍵斷裂等[24],在兩個因素的綜合作用下導致了高pH下蛋白質得率急劇降低。所以最佳堿溶pH為10.0。

圖3 堿溶pH對鷹嘴豆蛋白質得率的影響Fig.3 Alkali soluble pH value on yield of Chickpea protein

2.2.3 堿溶溫度對鷹嘴豆蛋白質得率的影響 由圖4可知,鷹嘴豆蛋白的得率在堿溶溫度較低時隨溫度的升高而增大,20～30 ℃得率升高明顯,由10.22%上升到了11.89%,在40 ℃時得率達到最高,為12.04%。繼續升高溫度時,蛋白得率反而下降,在60 ℃時降到了9.04%。得率升高是由于溫度增加,蛋白質的分子構象輕微改變,分子的立體結構伸展,有利于蛋白質分子和水分子的運動及其相互作用,溫度起到增溶作用[25]。蛋白質得率從40 ℃后開始下降,這是因為水分子的熱運動加劇使得蛋白質結構展開,維持蛋白質空間構象的次級鍵被破壞,非極性基團的暴露,導致蛋白質分子間發生聚集和沉淀,造成了得率降低[26]。因此確定最佳堿溶溫度為40 ℃。

圖4 堿溶溫度對鷹嘴豆蛋白質得率的影響Fig.4 Alkali soluble temperature on yield of Chickpea protein

2.2.4 堿溶時間對鷹嘴豆蛋白質得率的影響 由圖5可知,在其它條件相同的情況下,蛋白質溶解度會隨著時間延長略有增加,堿溶時間從30 min增加到90 min,得率也由9.04%增加到了9.77%。但溶液達到飽和后,增加堿溶時間對蛋白質得率的提高并不是很明顯,甚至還略微有所下降,當堿溶時間達150 min時,得率又降低至9.16%。這是由于溶解一定時間后,蛋白的溶出達到飽和,溶出率趨于平衡,若再進一步延長堿溶時間,可能因為長時間的攪拌導致部分蛋白質變性,從而使得率降低，或者是鷹嘴豆淀粉與蛋白質發生結合,導致蛋白質難以溶出[20]。因此,最佳堿溶時間為得率最高的90 min。

圖5 堿溶時間對鷹嘴豆蛋白質得率的影響Fig.5 Alkali soluble time on yield of Chickpea protein

2.3 響應面實驗結果

2.3.1 回歸模型的建立及顯著性檢驗 根據單因素試驗結果,由Design-Expert 8.0.6 Trial統計分析軟件設計出的試驗方案及結果見表2。以鷹嘴豆蛋白得率為響應值,以堿溶pH(A)、液料比(B)、堿溶時間(C)為自變量,建立三因素三水平中心組合試驗設計,共包括17個試驗方案。

對表2試驗結果進行多元回歸擬合,得鷹嘴豆蛋白質得率對pH(A)、液料比(B)和提取時間(C)的二次多項式回歸模型為:

表2 響應面試驗方案及結果Table 2 Experimental design and results for response surface experiment

Y=-49.32175+12.57250A+1.08912B-0.14126C+0.24875AB+9.91667×10-3AC+3.33333×10-4BC-0.83600A2-0.15087B2+2.46111×10-4C2

從表3可知,以蛋白質得率為響應值時,模型p<0.0001,表明該二次方程模型極顯著。同時失擬項p=0.0611>0.05,失擬項不顯著,說明所得方程與實際擬合中非正常誤差所占比例小,可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析[27]。其方程的決定系數R2=0.9927,表明有99.27%的數據可用此方程解釋。本實驗的CV值為0.72%,說明其置信度較高,模型方程能夠較好地反映真實的試驗值,可用此模型分析響應值的變化[28-29]。由表4還可以看出,A、C、AB、AC、A2、B2、C2對鷹嘴豆蛋白質得率的影響極顯著(p<0.01),B、BC對鷹嘴豆蛋白質得率的影響不顯著(p>0.05)。影響蛋白質得率的主次因素依次為A>C>B,即堿溶pH>堿溶時間>液料比。

表3 回歸模型及方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.3.2 響應曲面分析 由圖6a可知,堿溶時間為90 min時,隨著堿溶pH的升高,在低液料比下,蛋白質得率呈增大趨勢,但在高液料比下,蛋白質得率卻呈現出下降趨勢,這與液料比與pH之間負交互作用高度顯著有關。由圖6b可以看出,液料比為12∶1 mL/g,在堿溶時間為較低水平時,蛋白質得率隨著pH升高呈先升高后降低趨勢。

圖6 兩因素及其交互作用響應面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots showing the effects of threeprocess parameters on the extraction rate of chickpea protein注：固定水平:堿溶pH10,液料比12∶1 mL/g,堿溶時間90 min。

2.3.3 驗證實驗 通過軟件分析計算得出理論最佳提取工藝:堿溶pH10.02,液料比12.00∶1 mL/g和堿溶時間120.00 min,鷹嘴豆蛋白理論得率可達12.97%。進行驗證實驗時，為方便實際操作將堿溶pH定為10,其余條件不變,對優化參數進行3次平行驗證實驗,得鷹嘴豆蛋白平均得率為12.66±0.14%,與理論值相差2.39%，誤差較小說明實驗可行。

2.4 與已知優化方法的比較

周麗卿等[20]對新疆鷹嘴豆進行過蛋白質提取條件的優化,與本優化條件差異明顯。本優化條件中的液料比和堿溶pH分別為12.00∶1 mL/g與10.00,相較于參考方法中的17.70∶1 mL/g與11.00明顯降低;而本優化條件中的堿溶溫度和堿溶時間分別為40 ℃與120.00 min,則顯著高于參考方法中的20 ℃與88.40 min。所以,本研究參考周麗卿等的最佳優化參數對云南卡布里鷹嘴豆進行了三次蛋白質提取的重復實驗,同時將冷凍干燥得到的蛋白晶體研磨成粉后，測定了蛋白粉中的粗蛋白含量來驗證其純度,就蛋白質得率與蛋白粉純度與本研究中的優化方法進行比較,結果如表5所示。

表5 蛋白質得率與蛋白粉純度比較Table 5 Comparison of yield and purity of protein powder in different optimization parameters

如表5所示,僅從蛋白質得率來看,本法的得率(12.66%±0.14%)要低于參考方法(14.64%±0.30%),差異極顯著(p=0.003<0.01)。但是從所得到蛋白粉的純度來看,經本法所提取的云南卡布里鷹嘴豆蛋白粉純度(77.82%±0.53%)高于按照參考方法所提的蛋白質純度(69.86%±1.57%),差異極顯著(p=0.007<0.01)。

用本優化條件與周麗卿等人報道的方法[20]相比較,發現兩地的鷹嘴豆蛋白質等電點并不相同,這可能是由于選擇鷹嘴豆的來源不同,周麗卿等用的是來自新疆的鷹嘴豆,而本研究中的鷹嘴豆來源于云南文山州,兩地土壤、光照等生長條件的不同可能導致鷹嘴豆籽粒中蛋白質類型的不同,最終造成兩地鷹嘴豆蛋白質等電點的不同。采用本法提取鷹嘴豆蛋白,其得率略低于參考方法,但本方法得到的蛋白質純度卻顯著高于參考方法所得的蛋白質純度。本法與參考方法相比,所用的酸沉pH較高,本法為4.9,參考方法為4.3。在酸沉過程中不可避免地會引入少量淀粉等雜質。不同的酸沉pH使沉淀過程中引入雜質的量不同。而本法所用的最佳堿溶pH較低,只有10,而參考方法中所用的堿溶pH達到了11。過高的pH條件會引起蛋白質的變性。這可能是導致本法蛋白質得率略低但是所提蛋白粉純度較高的原因。

3 結論

本試驗確定了云南文山的卡布里品種鷹嘴豆總蛋白的等電點為4.9,可以為進一步測定云南卡布里品種鷹嘴豆中清蛋白和球蛋白的等電點提供依據。并通過Box-Behnken設計,建立了堿溶酸沉法云南卡布里鷹嘴豆蛋白提取工藝參數的二次多項式數學模型,經檢驗該模型是合理可靠的,能夠比較準確地預測鷹嘴豆蛋白的得率。堿溶酸沉法工藝參數中堿溶pH、堿溶時間對鷹嘴豆蛋白得率有極顯著影響(p<0.01),各因素影響主次順序為堿溶pH>堿溶時間>液料比。完成了對堿溶酸沉法條件的優化,確定了最佳工藝為40 ℃條件下液料比12∶1 mL/g、堿溶pH10、堿溶時間120 min,此時蛋白得率可達12.66%±0.14%，與理論值相差2.39%。

本文所得到的工藝參數具有針對性,既可以充分提取云南卡布里鷹嘴豆中的蛋白質,又可以得到較高純度的蛋白粉,并用于鷹嘴豆蛋白質的進一步研究,如功能肽的提取等;也可以用于食用蛋白粉的工業化生產,產生經濟效益,有助于推廣鷹嘴豆在云南地區進一步種植。