富硒香菇多糖發酵工藝的 優化及其抗氧化活性

曾璇竹,雷于國,胡國元,*,郭 嘉

(1.武漢工程大學環境生態與生物工程學院，湖北武漢 430205； 2.湖北裕國菇業股份有限公司,湖北隨州 441300； 3.綠色化工過程教育部重點實驗室,湖北武漢 430205)

硒(Selenium,Se)是人體必需的一種微量礦質元素,對維持機體的抗氧化活性及抵抗能力至關重要,具有防癌抗癌、延緩衰老等生理功能[1-2]。香菇(Lentinulaedodes)具有一定的富硒能力,由香菇富集的有機硒具有較好的穩定性,不僅方便貯存、運輸,還能夠更好地與食品中的其它成分配合,避免其中某些營養成分的流失,從而更容易被人體吸收利用[3]。富集硒后的香菇多糖是一種有機硒化合物,其生物藥理活性普遍高于多糖和硒,還能提供其它的有益營養元素和活性物質[4]。

本實驗采取液體深層發酵培養的方式,通過加入Na2SeO3溶液,研究培養基pH、硒滅菌方式、硒添加時間、硒添加量和發酵時間對富硒香菇多糖的影響,初步確定富硒香菇胞內及胞外多糖的最優發酵條件,并了解硒添加對香菇多糖DPPH自由基清除活性的影響,為富硒香菇發酵研究及深加工提供一定的參考和依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

秋栽7號 香菇菌種,湖北裕國菇業股份有限公司;玉米粉(食品級) 市售;葡萄糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、亞甲藍、亞硒酸鈉 均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司;酵母粉 安琪酵母股份有限公司;蛋白胨、酵母浸膏、瓊脂 北京雙旋微生物培養基制品廠;七水硫酸鎂、無水硫酸鎂 分析純,西隴化工股份有限公司;2,2-聯苯基-1-苦基肼基(DPPH) 上海化成工業發展有限公司;完全培養基(g/L) 葡萄糖20、酵母浸膏2、蛋白胨2、磷酸二氫鉀0.46、磷酸氫二鉀1、七水硫酸鎂0.05、瓊脂20、pH自然;液體種子培養基(g/L) 葡萄糖10、酵母粉20、玉米粉過0.15孔徑篩(100目)15、磷酸二氫鉀3、無水硫酸鎂1.5;發酵培養基 同液體種子培養基。

GNP-9080型隔水式恒溫培養箱 上海精密試驗設備有限公司;LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;CJ-2D潔凈工作臺 天津杰斯特設備有限公司;DK-S24電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司;MQT-60恒溫搖床 上海旻泉儀器有限公司;PHS-3C酸度計 上海理達儀器廠;SHZ-A循環式真空泵 鞏義予華儀器有限公司;BL-220H型電子天平 日本SHIMADZU公司;GZX-9030MBE數顯鼓風干燥箱 上海博訊實業有限公司;RE-52A旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;TG16-WS型離心機 長沙湘智離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化和馴化 將秋栽7號菌塊接入新鮮的完全培養基平板上活化,25 ℃恒溫培養7 d后,將活化好的菌種接種到硒濃度為1 mg/L的完全培養基平板上進行馴化,25 ℃恒溫培養7 d,讓菌種適應低濃度的硒[7-9]。

1.2.2 液體種子的制備 在250 mL三角瓶中,加入100 mL 的液體種子培養基和1 g/L的Na2SeO3溶液,使硒在液體培養基中的濃度為1 mg/L,每瓶打孔接種4個馴化好的菌餅(直徑約為0.672 cm)[10],靜置24 h以后,25 ℃搖床培養7 d,轉速為150 r/min。

1.2.3 硒源滅菌方式的確定 配置以下三種硒源滅菌方式不同的發酵培養基,裝液量為100 mL/250 mL。方式一:將亞硒酸鈉溶液添加至培養基后再一起高壓滅菌;方式二:亞硒酸鈉溶液與培養基分別高壓滅菌后再添加;方式三:亞硒酸鈉溶液過濾除菌后再添加至已高壓滅菌的培養基中;在無菌條件下將培養了7 d的液體種子接入發酵培養基中,接種量為10%,25 ℃、150 r/min下搖床培養10 d,測定生物量及胞內多糖提取量。

1.2.4 硒源添加濃度的確定 采用過濾除菌的方式對硒源進行滅菌,配制發酵培養基使硒的濃度分別達到0、4、6、8、10、12和14 mg/L,無菌條件下接入液體種子,接種量為10%,25 ℃、150 r/min下搖床培養10 d,測定生物量及胞內多糖提取量[11]。

1.2.5 硒源添加時間的確定 采用過濾除菌的方式對硒源進行滅菌,分別在發酵的第0、2、4、6、7和8 d加入8 mg/L亞硒酸鈉溶液[12],無菌條件下接入液體種子,接種量為10%,25 ℃、150 r/min下搖床培養10 d,測定生物量及胞內多糖提取量。

1.2.6 初始pH的確定 采用過濾除菌方式對硒源進行滅菌,將培養基的pH調至為3、4、5、自然(5.67)、6、7,無菌條件下接入液體種子,接種量為10%,第7 d時加入8 mg/L的亞硒酸鈉溶液,25 ℃、150 r/min下搖床培養10 d,測定生物量及胞內多糖提取量。

1.2.7 發酵時間的確定 采用過濾除菌方式對硒源進行滅菌,將培養基的pH調至4,無菌條件下接入液體種子,接種量為10%,第7 d時加入8 mg/L的亞硒酸鈉溶液,分別在發酵的第9、10、11、12和13 d結束發酵,25 ℃、150 r/min下搖床培養,測定生物量及胞內多糖提取量[13]。

1.2.8 Box-Behnken試驗設計 根據單因素實驗結果,固定硒源滅菌方式為過濾除菌,發酵時間為11 d,采用Box-Behnken試驗設計方法,以硒源添加濃度、硒源添加時間和培養基pH為相應變量,分別以X1、X2和X3表示,并以-1、0、1分別代表變量的水平,以富硒香菇多糖提取量為響應值,通過響應曲面分析進行制備條件的優化,從而得到最優發酵條件[14]。

表1 Box-Behnken設計試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.9 生物量的測定 發酵培養得到的香菇菌絲體與發酵液分離后,用蒸餾水反復沖洗,直至水洗液經亞甲藍鑒定后[15],無硒為止,60～80 ℃烘干至恒重,稱重即為香菇菌絲體生物量,并磨粉備用。

1.2.10 香菇多糖的提取量測定 稱取一定量1.2.9中獲得的菌絲體粉末,加入蒸餾水搖勻,料液比為1∶20(g/mL),靜止30 min,置于90 ℃恒溫水浴鍋浸提2 h。用布氏漏斗抽濾,獲得濾液。將濾液用旋轉蒸發儀均濃縮,濃縮比為1∶20(g/mL)。濃縮后加入無水乙醇至終濃度為60%,醇沉15 h后,4000 r/min下離心15 min,去上清液,烘干至恒重后稱重,即為香菇胞內多糖提取量。發酵液抽濾除去菌絲體,濃縮發酵液至原體積1/4,加入無水乙醇,乙醇濃度為75%,醇沉15 h后,4000 r/min離心15 min,去上清液,烘干至恒重后稱重,即為香菇胞外多糖提取量[16-18]。

1.2.11 香菇多糖的純化及抗氧化活性的測定 經優化后的最佳發酵條件下獲得富硒香菇胞內及胞外多糖,脫蛋白[19-20]后,同1.2.10的方法醇沉烘干并磨粉。并按一定梯度(200～1000 μg/mL)溶解粉末后待測,以相同條件下未加硒源發酵培養得到的香菇胞內及胞外多糖及VC做對比[21-22],實驗分為樣品組、對照組和空白組,加入樣品和0.2 mmol/L DPPH自由基溶液后,用渦旋振蕩器充分混勻,避光反應30 min,517 nm處測定吸光值。

DPPH清除率(%)=[1-(A樣品-A對照)/A空白]×100

式中，A樣品為樣品(2 mL)+DPPH溶液(2 mL)的吸光度;A對照為樣品(2 mL)+無水乙醇(2 mL)的吸光度;A空白為DPPH溶液(2 mL)+無水乙醇(2 mL)的吸光度[23-25]。

1.3 數據統計分析

上述實驗均設置3組平行,用Excel 2007軟件對數據進行平均數和標準偏差的統計分析,結果以平均值±標準偏差表示。響應面實驗設計和數據分析采用Design-Expert V8.0.6.1軟件,采用Tukey-Kramer post-hoc test對實驗結果進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 硒源滅菌方式對富硒香菇液體發酵的影響

如圖1可知,方式一的生物量最高為1.2149 g/100 mL,三種方式下所得到的生物量較相近。方式三的胞內多糖提取量最高為32.4 mg/100 mL,方式三的胞內多糖提取量明顯高于方式一。三種硒源滅菌方式下得到的菌絲體形態有明顯差異,方式一得到的菌絲球呈粉紅色,這是由于生物的紅硒化現象,細胞將毒性較大的亞硒酸鈉還原成無毒的硒元素,紅色硒元素是一種人體不能吸收利用的硒形態[26],所以在實踐生產中應盡可能減少紅硒現象發生,為此選用相對安全且胞內多糖提取量高的方式三(過濾除菌方式)對硒源進行滅菌。

圖1 硒源滅菌方式對富硒香菇發酵的影響Fig.1 Effects of sterilization conditions of Se on Se-enriched L. edodes

2.2 培養基硒濃度對富硒香菇發酵的影響

由圖2可知,隨著硒濃度的增高,胞內多糖的提取量波動比較明顯,加硒濃度為6 mg/L時,菌絲體中胞內多糖提取量達到峰值,為33.8 mg/100 mL。加硒濃度為8 mg/L時,菌絲體生物量最高達1.1032 g/100 mL。由圖2可知,加硒濃度在6～8 mg/L時,其生物量和胞內多糖提取量均高于未加硒時的值,說明加硒不僅能促進生物量的增加,也能促進胞內多糖的生成。通過比較,初步確定培養基中加入8 mg/L的Na2SeO3溶液為富硒香菇發酵的最佳硒添加量。

圖2 硒濃度對富硒香菇發酵的影響Fig.2 Effects of Se concentration on Se-enriched L. edodes

2.3 加硒時間對富硒香菇液體發酵的影響

由圖3可得,生物量的值相對比較穩定,第7 d時達到1.0812 g/100 mL。從菌絲中提取的胞內多糖提取量來看,第7 d前添加,胞內多糖提取量走勢比較平緩,在第7 d添加時,提取出的胞內多糖提取量最高為57.6 mg/100 mL,且遠遠高于其他組。在第8 d添加時,胞內多糖提取量下降至26.9 mg/100 mL,說明在菌絲體生長過程中添加亞硒酸鈉溶液,對富硒香菇多糖的影響較大,第7 d添加為富硒香菇發酵中硒源的最佳補添時間,可促進菌絲體內胞內多糖的積累。

圖3 硒添加時間對富硒香菇發酵的影響Fig.3 Effects of Se replenishing time on Se-enriched L. edodes

2.4 培養基pH對富硒香菇發酵的影響

培養基自然pH為5.67±0.012。由圖4可知,在pH=4時,生物量達到最大值1.4848 g/100 mL,相對于空白組(pH=5.67)高出1.5倍,胞內多糖提取量也達到最高值39.8 mg/100 mL。由此可見,培養基pH對富硒香菇發酵的影響較大,富硒香菇能更好地適應酸性環境。當pH大于4且逐漸升高時,生物量及胞內多糖的提取量均呈下降趨勢,pH=7時,不管是生物量還是胞內多糖提取量均受到非常明顯的抑制作用,幾乎是停止了生長。因此可將培養基pH調至4,此時的生物量及胞內多糖的提取量都達到最大。

圖4 培養基pH對富硒香菇發酵的影響Fig.4 Effects of medium pH on Se-enriched L. edodes

2.5 發酵時間對富硒香菇液體發酵的影響

由圖5可得,富硒香菇發酵從第9～11 d的生物量一直處于迅速增長的趨勢,到第11 d時,生物量達到峰值,為1.0037 g/100 mL,第11～13 d中,生物量增長平緩。胞內多糖提取量也在發酵第11 d時達到最大值,為29 mg/100 mL,第11 d后,胞內多糖提取量開始降低,降低幅度相對較快。因此確定富硒香菇發酵的最佳時間為11 d。

圖5 發酵時間對富硒香菇發酵的影響Fig.5 Effects of fermentation time on Se-enriched L. edodes

2.6 響應曲面法優化富硒香菇發酵工藝

根據Box-Behnken響應面設計原理,在單因素實驗的基礎上,以香菇胞內及胞外多糖提取量為響應值,響應面實驗設計及結果見表2。

表2 響應面分析實驗方案與結果Table 2 Box-Behnken experimental design and results for response surface analysis

表3 富硒香菇胞內多糖的響應面分析試驗方差分析結果Table 3 Analysis of variance for the developed regression model of intracellular polysaccharide of Se-enriched L. edodes

圖6 各兩因素交互作用對富硒 香菇胞內多糖影響的響應面圖Fig.6 Response surface plots showing the interactive effects of various fermentation conditions on the intracellular polysaccharide of Se-enriched L. edodes

表4 富硒香菇胞外多糖的響應面分析試驗方差分析結果Table 4 Analysis of variance for the developed regression model of extracellular polysaccharide of Se-enriched L. edodes

圖7 各兩因素交互作用對富硒香菇 胞外多糖影響的響應面圖Fig.7 Response surface plots showing the interactive effects of various fermentation conditions on the extracellular polysaccharide of Se-enriched L. edodes

相比之下,B圖響應面曲線的坡度最大,說明X1加硒濃度和X3培養基pH兩者的交互作用對胞外多糖提取量有明顯影響。X2加硒濃度在6～7 mg/L,X3培養基pH在4～4.5的范圍內存在極值,說明兩者之間存在較好的交互作用。通過對胞外多糖的發酵條件進行優化,得出的最佳發酵條件為:采用過濾除菌方式對硒源滅菌,培養基pH調至4.01,發酵至第7.98 d(191.5 h),向發酵液中添加6.68 mg/L Na2SeO3,發酵11 d,此時胞外多糖提取量預測響應值為895.68 mg/100 mL。為檢驗RSM的可靠性,進行驗證實驗,得實際值853.96 mg/100 mL。驗證值與理論值間的相對誤差為4.65%。富硒香菇胞內及胞外多糖提取量在一定范圍內隨加硒濃度、加硒時間和培養基pH的增加而提高,當其水平越過一定值后,富硒香菇胞內及胞外多糖提取量隨之將降低[28]。

2.7 香菇多糖DPPH自由基清除能力比較

將四種脫蛋白后的香菇多糖進行不同倍數的稀釋,其DPPH自由基清除率如圖8所示。隨著溶液濃度的上升,DPPH自由基清除率也上升,可見香菇多糖對DPPH自由基有一定清除效果,四種香菇多糖對清除率的作用影響由大到小的順序為富硒香菇胞內多糖>香菇胞內多糖>富硒香菇胞外多糖>香菇胞外多糖,實驗結果表明,香菇胞內多糖的清除能力明顯優于香菇胞外多糖的清除能力,硒的添加能提高了香菇胞內及胞外多糖對DPPH自由基的清除效率。富集硒的過程不僅提高了香菇多糖提取量,同時也提高了其抗DPPH的清除能力[29-30]。

圖8 香菇多糖的DPPH自由基清除能力Fig.8 DPPH scavenging rate with diferent concentrations of L. edodes polysaccharide

3 結論

為優化富硒香菇多糖的發酵條件,進行了單因素和響應面的實驗分析,得出最佳發酵條件,當培養基pH調至4.16,發酵至第162 h時向發酵液中添加7.97 mg/L過濾除菌的Na2SeO3溶液,發酵11 d,富硒香菇胞內多糖提取量可達到71.54 mg/100 mL;當培養基pH調至4.01,發酵至第191.5 h時向培養基中添加6.68 mg/L過濾除菌的Na2SeO3溶液,發酵11 d,富硒香菇胞外多糖提取量可達到853.96 mg/100 mL。結果顯示,富硒可以促進菌絲合成,有助于菌絲的生長及多糖的累積。香菇多糖對DPPH自由基有一定清除效果,香菇胞內多糖的清除能力明顯優于香菇胞外多糖的清除能力,硒的添加能提高了香菇胞內及胞外多糖對DPPH自由基的清除效率富集硒的過程不僅提高香菇多糖提取量,同時也提高了其抗氧化活性作用。本試驗在香菇液體發酵生成多糖的過程中,加入無機硒,使硒元素與香菇多糖有機結合,并優化其發酵條件,得到的富硒香菇多糖既能夠保持多糖的基本構型和生物活性,又避免了無機硒對人體的毒性和副作用,富硒香菇多糖作為一種安全、有效、健康的硒營養源,開發前景十分可觀。