基于主成分分析和聚類分析的 蘋果香氣成分比較及品種分類研究

張薇薇,張秀玲

(東北農業大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030)

蘋果是世界上最重要的水果之一,也是世界四大水果之一,深受消費者喜愛。蘋果是我國膳食的重要組成部分,在水果領域中具有重要的地位[1]。蘋果中含有豐富的維生素C、維生素A、胡蘿卜素、鈣、鐵和鉀等,可以為人體補充所需的多種維生素和礦物質[2]。在中國,無論其種植面積還是產量均位居各水果之首。我國2015年蘋果總產量為4260萬噸,2016年蘋果總產量達4350萬噸,其中2016年產量占世界總產量的56%[3]。蘋果品種數以千計,我國的主要品種有:遼伏、新紅星、喬納金、秦冠、王林、富士系品種、澳洲青蘋、國光、紅將軍、喬納金、華冠、棲霞蘋果—紅富士、花牛、金帥等。

在近些年的研究中,香氣成分已逐漸受到重視。研究發現在果品鮮食、加工質量等領域中,香氣已成為品質評價的重要因素[1],因此研究蘋果果實香氣,能夠為改善蘋果品質和蘋果深加工提供理論參考[4]。目前針對蘋果香氣的研究大部分集中于單一品種且對香氣成分處在初步檢測階段。Wu等[5]對8個品種的蘋果進行香氣化合物探究,得出酸、糖是影響蘋果香氣的主要原因。Farneti等[6]研究蘋果的動態揮發性有機化合物并建立了香氣化合物動態模型。Young等[7]對蘋果中酯類物質的變化進行了研究。Sepp?等[8]研究了蘋果在貯藏過程中香氣和質構的變化特征。Varela等[9]對富士蘋果在貨架期內香氣的變化規律進行了探討,確定醇、酯、醛、酮是主要的香氣成分。Moyaleon等[10]對氣調貯藏條件下皇家嘎啦的香氣變化進行了討論,發現氣調貯藏可以抑制香氣中酯類物質的生成。以上實驗均對單一品種進行香氣研究,并未對多品種香氣成分進行比對探討。因此,本實驗主要對不同產地不同品種蘋果進行香氣檢測,并對香氣化合物進行定量,采用多元統計分析法中的主成分分析對蘋果香氣物質進行分類,旨在為蘋果香氣研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘋果 本實驗采用來自7個產地14個品種,分別是遼寧興城國光、新紅星、華富、秋錦、昌紅、喬納金、新民寒富、山東泰安小國光、山東泰安紅富士、山西秦冠、甘肅富士、河北王林、河北富士和新疆冰糖心富士,蘋果分別采摘自不同果樹,每個品種共取50個,以上蘋果成熟度為8～9成,采收時間為2016年11月;NaCl、2-辛醇 分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

WZB 45數顯折光儀 上海精密科學儀器有限公司;D25LT可見光色度計 美國Hunter Lab公司;TA-XT2i質構儀 英國Stable Micro systems公司;BSA4202S(0.01 g)電子天平 德國Sartorius公司;GMK-835F型蘋果酸度計 常州銳品精密儀器有限公司;SPME自動進樣器AOC5000 日本島津公司;PDMS、PDMS/DVB、CAR/PDMS萃取頭 美國Supelco公司;GC/MS-QP2010Plus、聚四氟乙烯隔墊 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 硬度的測定 硬度(果皮硬度和果實硬度)使用質構儀進行測定,果皮硬度為探頭感應到的最大值(N)。測定硬度時選取蘋果果實陰陽面,各取3個點進行測定。果實硬度值為用感應力平衡后5～10 s之間測定的感應力的連續積分平均值。分別選取14個品種的蘋果,每個品種取25個重復。

1.2.2 可溶性固形物的測定 參照NY/T2637-2014[11]測定可溶性固形物含量。分別選取14個品種的蘋果,將蘋果洗凈,均勻切丁,放入攪碎機中打碎,每個蘋果稱取5 g。用蒸餾水調零數顯折光儀,隨后將打碎的蘋果分別滴入折光儀中,測定可溶性固形物數值。分別選取14個品種的蘋果,每個品種取25個重復。

1.2.3 色澤的測定 果皮顏色(L*值,a*值,b*值)采用D25LT可見光色度計在L*、a*、b*模式下測定[12]。分別選取14個品種的蘋果,每個品種取5個重復。將蘋果清洗、擦干,用去皮器削去果皮,平鋪于面板上。開機校正色差儀,隨后將探頭按于果皮表面,測定果皮色澤,之后將蘋果切開,迅速測定果肉色澤,每個蘋果重復5次。

1.2.4 總酸的測定 參照GB/T 12456-2008[13]測定總酸含量,采用酸度計測定。分別選取14個品種的蘋果,每個品種取25個重復。

1.2.5 香氣成分的提取 參考實驗室前期研究結果,將每個品種蘋果隨機挑選若干,洗凈四分法切分,之后切成細碎顆粒混勻,準確稱量2 g于頂空瓶中,并在頂空瓶中加入2 mL去離子水、0.6 g NaCl,以便使芳香物質充分散發出來。再將100 μL內標2-辛醇(體積濃度為0.822 mg/L)加入頂空瓶內,然后用聚四氟乙烯隔墊蓋上密封,采用固相微萃取-氣相-質譜(SPME-GC-MS)進行香氣的檢測。每個品種三個平行試驗。

1.2.6 SPME-GC-MS測定條件 SPME條件:本實驗采用的萃取頭為65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯苯(PDMS/DVB),實驗前須先在220 ℃老化40 min后使用。磁力攪拌器轉速為240 r/min,萃取溫度為40 ℃,萃取的吸附時間為50 min。

氣相色譜條件:色譜柱DB-WAX,30 mm×0.25 mm×0.25 μm,解析溫度為200 ℃,解析時間為5 min,升溫程序為初始50 ℃保持3 min,以8 ℃/min的速度升到120 ℃,再以15 ℃/min升溫到220 ℃保持5 min。載氣為高純氦氣(純度為99.999%),恒壓52.5 kPa,總流量36.8 mL/min,流速為35.9 mL/min,無分流進樣。

質譜條件:離子能量80 eV,質譜接口溫度為250 ℃,掃描質量范圍為35～500 u,離子源溫度為180 ℃,電離方式EI,解析時間3 min。

1.2.7 定性分析與定量分析 定性分析:將固相微萃取所得香氣成分,用氣相色譜-質譜聯用儀進行分析鑒定。通過G1701BA數據處理系統并檢索譜圖庫,然后與EPA/NIH質譜圖集的標準譜圖進行對照,選擇與譜庫匹配相似度大于85的化合物作為該峰的定性化合物,再結合相關文獻進行解析。定量分析:通過G1701BA數據處理系統,通過峰面積對比,以得到蘋果中各香氣成分的相對含量。

1.3 數據處理

本實驗所得數據均使用Microsoft office excel 2010和SPSS Statistics 21軟件進行描述性分析、主成分分析、聚類分析的統計分析。

2 結果與分析

2.1 基本理化指標

測定本實驗所用14種蘋果的6個品質性狀,其結果見表1。

描述性統計是用來概括、表述事物整體狀況以及事物間關聯、類屬關系的統計方法。通過統計處理可以簡潔地用幾個統計值來表示一組數據的集中性和離散性(波動性大小)。本實驗將測得的不同品種蘋果基本理化指標進行描述性分析,用以比對不同品種蘋果間理化指標的差異。將14個蘋果品種進行描述性分析,結果見表2。其中,果肉L值的變異系數為2.6%,不同品種間果肉L值變異系數較小,說明不同品種間果肉的亮度值差異不顯著(p>0.05)。本試驗結果表明,除該項指標未表現出較大的變異系數外,其余7項指標的變異系數均較大,這說明不同品種蘋果間品質指標差異性較大。果肉顏色a值的變異系數為305.88%,其數據離散程度較大,表明各蘋果品種間的測定值差異較大,此結果可能與蘋果果肉中多酚氧化酶的活性指標相關,多酚氧化酶活性較高時,果肉色澤易發生變化[14]。比較數據的均值和中位數發現,除果肉a值外,其他品質指標的中位數均接近其平均數,說明這些數據的離群點較少。以上試驗結果表明,試驗所選蘋果品種各指標均在接受范圍內,離群點較少,具有一定的廣泛性和代表性。在本研究中所選取的蘋果具有相同栽培管理條件和成熟度,因此蘋果果實品質性狀的多樣性主要是由品種及地域差異造成的[15-17]。

表2 蘋果品質描述性統計Table 2 Descriptive statistics of apple characterization

2.2 香氣構成

采用SPME-GC-MS測定并分析蘋果中香氣成分,共鑒定出70種化合物,用峰面積歸一化法計算各組分的相對含量[18]。其中,酯類33種、醛類11種、醇類19種、酮類2種、其他類6種。

經檢測14種蘋果中共有香氣成分為8種,分別是乙酸己酯、己酸己酯、2-甲基-1-丁醇、1-己醇、1-辛醇、己醛、反式-2-己烯醛、α-法呢稀。己酸乙酯在小國光、秋錦、王林、(新)冰糖心富士、寒富、(甘)富士和(河)富士中檢測到,順式二己烯一醇乙酸酯在秋錦、(山)富士、王林、(新)富士、華富、(甘)富士、(河)富士和喬納金中檢測到,乙酸丁酯在(山)富士、王林、(新)冰糖心富士、(甘)富士和(河)富士中檢測到,反式-2-己稀-1-醇在新紅星、秦冠、(新)冰糖心富士、寒富、昌紅和喬納金中檢測到。在不同蘋果品種中,1-己醇、己醛和反式二己烯醛3種組分的含量最高,其相對含量之和都占到各自總含量1%～50%,成為蘋果典型風味的基本物質[19]。通過檢測可以發現,天然存在于蘋果中的香氣成分為乙酸己酯、丁酸己酯、己酸己酯[20]。不同產地富士蘋果成熟的最佳標志是香氣成分中含有2-甲基丁基乙酸酯[21-22],導致蘋果皮褐變的主要成分為α-法呢烯的氧化產物[18]。通過本試驗檢測結果,不同產地富士品種中檢測出的共有成分為乙酸己酯、α-法呢稀、順式-2-己烯-1-醇乙酸酯、己酸己酯、2-甲基丁酸丁酯、1-己醇、1-丁醇、己醛、2-甲基丁基乙酸酯、反式-2-己烯醛、乙酸丁酯、2-甲基-1-丁醇,且根據實驗可以看出富士品種雖產地不同,但主要呈香成分差異不大。而通過查閱文獻可知1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、己醛、2-甲基丁酸丁酯是富士蘋果中典型芳香成分[23],山東富士蘋果中上述組分比較豐富,明顯高于其它三個產地。由本實驗可以看出,相同蘋果品種在不同產地由于受氣候、土壤等因素的影響,香氣成分含量有差異,整體成香成分差別明顯,此結論與何義等[24]所得出結論一致。另外,本實驗發現不同產地不同品種蘋果主要成香組分有1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、l-己醇、己醛、反式-2-己烯醛、乙酸丁酯、乙酸戊酯、2-甲基丁酸丁酯、乙酸苯甲酯[25],由于品種及產地不同導致其組分和含量均存在區別。此外,本實驗檢測結果顯示4-己烯-1-醇乙酸酯僅在秋錦中檢測到,這可能與蘋果自身品種有關;2-甲基丁酸丁酯僅在(山)富士中檢測到,2-甲基丁酸乙酯僅在(新)冰糖心富士中檢測到,而其他產地富士中均未檢測到該成分,此結果可能與蘋果種植產地有關。喬納金蘋果中辛酸己酯含量較高;昌紅蘋果中順式-3-己烯-1-醇和乙偶姻含量較高;華富蘋果中乙醇含量較高,以上檢測成分均可能是構成不同品種蘋果呈香的風味物質。

表3 不同品種蘋果主要香氣成分相對含量(%)Table 3 The relative content of the main aroma components of different varieties of apples(%)

續表

香氣值是香氣物質濃度與香氣物質閾值的比值[26],因此香氣值的概念常被引用于香氣分析中。檢測出的香氣成分香氣值越大,表明該成分對食品香氣所起的作用就越大,而當香氣值恰好為1時,表明該成分可以對食品香氣起作用;而香氣值小于1,則表示該成分對嗅覺器官無明顯作用。因此,香氣值可以作為評價食品香氣特性的依據[23]。由表4可知,本實驗檢測出富士共有的香氣成分中香氣值均大于1的成分為2-甲基丁酸乙酯、l-辛醇、己酸乙酯、己醇、2-甲基-1-丁醇、乙酸乙酯、乙酸己酯,由此可以推斷這些成分對富士蘋果的呈香起關鍵作用。己醛、2-甲基丁酸乙酯、2-甲基丁酸甲酯、己酸乙酯雖然在蘋果中含量不是很高,但由于這些成分具有非常低的閾值,因此這三種組分對蘋果特有的香氣也起著重要的作用[23]。經查閱文獻發現,富士蘋果最主要的揮發性香氣成分是2-甲基丁基乙酸酯,該成分具有香蕉和蘋果的氣味[27]。由文獻可知,乙醛呈青香氣味,乙酸乙酯似醚氣味,丙酸乙酯具有青蘋果氣味,2-甲基-1-丁醇香味清爽,1-己醇具有水果香味,反式2-己烯醇有強烈的青香氣味且有蔬菜香和草香氣息,己酸乙酯具有蘋果香,丁酸乙酯呈甜蘋果香,己醛具有青酸蘋果香,乙酸己酯具有甜蘋果香,乙酸丁酯呈菠蘿果香[28]。

表4 主成分分析解釋總差異Table 4 Principal component analysis explains the total difference

2.3 主成分分析

將檢測結果進行主成分分析,分析結果如表4。主成分特征值大于1,方差貢獻率分別為51.110%和19.265%,其累積方差貢獻率為70.367%,綜合了不同品種蘋果香氣成分的大部分信息。因此,提取前2個主成分較為合適。主要綜合了醛類、酮類和酯類物質等信息的第一主成分中,醛和酮呈正向分布,酯類和醇類呈負項分布。由于醛類物質在第一主成分中占比較高,因此醛類物質是PC1的代表成分。第二主成分PC2方差貢獻率為19.265%,主要包括酯類和其他類物質的主要信息,其中,酯類物質在在第二主成分的負半軸,其他類物質在正半軸。由于酯類物質在PC2中占比較高,因此酯類物質是PC2的代表成分,荷載圖如圖2。通過圖2可以看出,王林及富士品種蘋果大部分均在PC2的負半軸,說明王林及不同產地富士蘋果酯含量較高,而昌紅則在正半軸,說明昌紅品種醇類物質含量較高;秋錦、新紅星和國光均落在PC1正向區間,說明這其醇含量較高;華富、秦冠、小國光、河北富士、甘肅富士、寒富各個成分含量較為均勻。

表5為各類香氣主成分載荷矩陣與特征向量,根據表5建立前兩個主成分的線性回歸方程:PC1=-0.965×Zscore(酯類)-0.598×Zscore(醇類)+0.763×Zscore(醛類)+0.702×Zscore(酮類)+0.131×Zscore(酸類)+0.245×Zscore(其他類)

表5 主成分載荷矩陣與特征向量Table 5 Loading matrix and eigenvectors of principal components

PC2=0.840×Zscore(酯類)+0.207×Zscore醇類)+0.407×Zscore(醛類)+0.292×Zscore(酮類)-0.279×Zscore(酸類)-0.427×Zscore(其他類)

式中，Zscore為經過標準化后的數值。

圖1 主成分載荷圖Fig.1 Plot of principal component analysis

本實驗利用權重系數將不同產地不同品種蘋果進行排名分析,計算結果如表6所示。由表6可知,綜合得分前兩名為寒富和昌紅,以上品種均位于載荷圖第二象限,昌紅品種的醇含量較高,而富士品種的酯類和醇類物質含量均較高,且各項成分含量較為均勻。綜合得分第3～10名位于載荷圖第三象限和各個象限的交界處。綜合得分第10到最后一名為華富、國光、秦冠和秋錦,綜合得分第13名為秦冠。此結果可以直觀的通過香氣成分顯示蘋果品種的優劣。

表6 不同種類蘋果的綜合得分和排名Table 6 Comprehensive scores and ranks of different cultivars of apple

2.4 聚類分析

使用 SPSS 21分析軟件,聚類方法為組間聯接,結果如圖2所示。由圖2可知,當類間距為25時,將14種蘋果分為兩類。第一類聚集了12個品種,即山東富士、王林、新疆冰糖心富士、寒富、小國光、華富、秦冠、甘肅富士、喬納金、河北富士、昌紅、秋錦。以上品種的各香氣成分含量無明顯差異,此結果與主成分分析結果一致。第二類主要聚集了2個品種,即新紅星和國光。該類品種醛類化合物含量最高,其中E-2-己烯醛含量明顯高于其他品種。當類間距為15時,將14種蘋果分為四類。第一類聚集了11個品種,即山東富士、王林、新疆冰糖心富士、寒富、小國光、華富、秦冠、甘肅富士、喬納金、河北富士。該類品種酯類物質的含量較高,其余各組分含量均勻,無明顯差異。第二類聚集了2個品種,即新紅星和國光,這與主成分分析中PC2分析的結果一致。該類品種醛類化合物含量最高,其中E-2-己烯醛含量明顯高于其他品種。秋錦和昌紅自成一類,昌紅品種中醇含量顯著高于其他品種,秋錦中α-法呢烯含量明顯低于其他品種,這與主成分分析中PC1分析結果一致。

圖2 聚類分析譜系圖Fig.2 Dendrogram of HCA(hierarchical cluster analysis)

3 討論

研究發現,蘋果中香氣成分有酯類、醛類、醇類和烴類等[29-31],目前已檢測出的300余種揮發性香氣成分,大部分是酯類,少部分是醇類與醛類,其中僅有約20種特征性香氣成分可以決定果實的氣味。研究發現,雖然有些成分含量非常少,但由于其具有較低的閾值,所以能夠影響果實的整體香味[32]。本試驗所用的遼寧興城國光、新紅星、華富、秋錦、昌紅、喬納金、新民寒富、山東泰安小國光、山東泰安紅富士、山西秦冠、甘肅富士、河北王林、河北富士和新疆冰糖心富士共檢測出73種香氣成分,主要特征香氣成分有丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸己酯、與2-甲基丁酸己酯等,這四種成分中,乙酸己酯、2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯被描述為“果香型”[33-35],如王林為果香型蘋果品種;2-甲基丁酸己酯被描述為“肉質果香型”[28],如秦冠和喬納金等為肉質果香型蘋果品種,以上香氣成分均為參試蘋果品種提供了基本的香味特征;其它特征香氣成分,如1-丁醇和2-甲基-1-丁醇,分別被描述為“甜香型”和 “令人愉悅型”香氣成分[34],代表品種為富士。香氣成分的不同決定了品種果實香味的特異性,根據文獻記載[23],酯類含量較高的蘋果品種稱為濃香型蘋果,醛類含量較高的稱為清香型蘋果,本試驗中具有代表性的濃香型蘋果為新紅星和富士,清香型蘋果國光和華富等。另外,研究發現食品香氣的最終表達不僅與單一香氣成分有關,同時也與香氣成分種類數有關[36]。

4 結論

本實驗擬為蘋果香氣分析及分類提供理論支持。通過對遼寧興城國光、新紅星、華富、秋錦、昌紅、喬納金、新民寒富、山東泰安小國光、山東泰安紅富士、山西秦冠、甘肅富士、河北王林、河北富士和新疆冰糖心富士的芳香物質研究,發現蘋果的主要香氣成分包含醇類、酯類、醛類、酮類、醛類和其他類6類香氣物質。其中2-甲基-1-丁醇、丁酸乙酯、己醛、乙酸丁酯、丙酸乙酯、己醇、2-甲基丁酸乙酯、乙酸己酯、1-丁醇、己酸乙酯為不同產地不同品種蘋果的主要香氣成分,不同產地不同品種蘋果在醇、醛和酯類上存在一定差異。蘋果因不同的香氣成分而表現出不同氣味,如本實驗中的甜香型蘋果新紅星、王林和富士,清香型蘋果國光和華富,均可根據具體香氣成分差別將其進行分類。由此可見,香氣成分可以作為蘋果品種選育和標準評價的指標。而主成分分析與聚類分析則可以有效的區分蘋果品質優劣并進行品種篩選。本實驗經過分析篩選,得到的不同產地富士、王林、昌紅和寒富四種蘋果香型特點更為突出,為育種者和消費者優選蘋果的提供理論基礎和參考。