茶葉中10種農藥殘留的 液相色譜-串聯質譜法 和氣相色譜-串聯質譜法測定

胡雪艷,彭 濤,陳 輝,王雯雯

(1.中國檢驗檢疫科學研究院,北京 100176; 2.安捷倫科技有限公司,北京 100102)

近年來,我國的茶葉產業得到了很大發展,茶葉出口國家和地區已經達到120余個,出口的茶葉品種不斷增加。目前,我國茶葉出口主要有歐盟、美國、日本等國際市場,其中歐盟和日本作為我國茶葉出口兩大主要市場,均對茶葉制定了非常苛刻的農藥殘留限量標準,截止到2015年7月,歐盟和日本對茶葉中農藥殘留最大限量(MRL)都做了嚴格的規定,其中歐盟459種,日本240種[1-2]。茶葉出口的農藥殘留限量標準的不斷提高,直接影響了中國茶葉出口的數量。本文研究的10種農藥是FAPAS茶葉標準物質(19184)能力測試樣品中含有的農藥,歐盟和日本肯定列表中均對MRL做了嚴格限量,如歐盟規定了啶蟲脒、溴氰菊酯、樂果、吡蟲啉、高效氯氟氰菊酯、滅多威、p,p′-滴滴伊、甲基嘧啶磷、腐霉利、噠螨靈的MRL分別為0.05、5、0.05、0.05、1、0.1、0.2、0.05、0.05、0.05 mg/kg。從2012年起至2015年初,歐盟食品飼料快速預警系統(RASFF)通報顯示,我國出口歐洲的6批茶葉產品因農藥殘留超標被歐盟成員國通報[3]。而我國在2013年3月1日實施《食品中農藥最大殘留限量》(GB 2763-2012)之前,對茶葉的農藥殘留限量標準只有9種,GB 2763-2012實施后涉及茶葉中農藥殘留25項,其中部分指標與日本的殘留限量對比,我國的限量要求更為嚴格(除殺螟硫磷指標限量),說明我國與世界的限量標準在一步步的接軌中。但在我國,真正把茶葉農藥殘留限量標準的政策措施落到實處還有很長的一段路要走。因而,探索上述農藥的快速、準確的檢測方法十分必要。

本文研究的10種農藥均是在茶葉種植過程中經常使用的農藥,目前,國內外涉及上述10種農藥的檢測方法主要有氣相色譜-串聯質譜(GC-MS/MS)[4-8]、液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)[9-14]、GC-MS[15-16]等。Tomas等[7]采用茶葉水化后,液液萃取的前處理方式,建立了茶葉中135種農藥的GC-MS/MS檢測方法;Chen等[9]采用改進的QuEChERS前處理方式,建立了茶葉中65種農藥的LC-MS/MS檢測方法;賈瑋等[14]采用改進的QuEChERS前處理方式,樣品經乙腈直接提取,建立了茶葉中290種農藥的LC-MS/MS檢測方法,以上這些方法檢測農藥數量雖然較多,但均未能同時包含這10種農藥的測定。提取方法方面,以上文獻均未考察過浸泡提取對農藥提取效率的影響。本方法針對FAPAS茶葉標準物質(19184)能力測試樣品中含有的10種農藥在檢測中存在的問題,并參考GB/T 23204-2008[17]和GB/23200.13-2016[18]方法,對茶葉實際樣品中存在的10種農藥殘留的檢測進行了優化。檢測中發現提取過程如果采用直接均質提取無法達到最佳的提取效率,于是對浸泡提取時間進行了優化。由于茶葉樣品基質復雜,本文采用基質匹配標準曲線來降低基質對準確定量的干擾。本實驗對茶葉中農藥殘留實際的檢測工作具有一定的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

啶蟲脒(acetamiprid)、溴氰菊酯(deltamethrin)、樂果(dimethoate)、吡蟲啉(imidacloprid)、高效氯氟氰菊酯(lambda-cyhalothrin)、滅多威(methomyl)、p,p′-滴滴伊(p,p′-滴滴伊)、甲基嘧啶磷(pirimiphos-methyl)、腐霉利(procymidone)、噠螨靈(pyridaben)標準品(純度均大于95%) 德國Dr.Ehrenstorfer公司;乙腈、甲苯(均為色譜純) 美國Honeywell公司;甲酸(純度大于96%) 美國MREDA公司;Cleanert TPT固相萃取小柱(2 g/12 mL) 天津博納艾杰爾科技有限公司;所測定的茶葉樣品為茶葉標準物質(編號:19184,白茶)及其空白茶葉 北京中檢維康技術有限公司。

Agilent 1290-6460液相色譜-串聯質譜儀(配有電噴霧電離源) 美國Agilent公司;Agilent 7890A-7000B氣相色譜-串聯質譜儀(配有電子轟擊電離源) 美國Agilent公司;T25均質器 德國IKA公司;N-EVAP-112型氮吹儀 美國Organomation公司;R-215旋轉蒸發儀 瑞士Buchi公司;KDC-40離心機 中國中佳公司;SYNER型超純水發生器 美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品溶液制備 溴氰菊酯為溶于丙酮中濃度為0.1022 mg/mL的標準溶液,其他9種農藥標準品為固體,分別準確稱量9種固體農藥標準品,均用甲醇配制成濃度約為1.0 mg/mL的單一標準儲備液;將10種農藥配制成濃度為5 mg/L的混合標準溶液,于1～4 ℃下冷藏避光保存。磷酸三苯酯(triphenyl phosphate,TPP)為氣相色譜-串聯質譜法測定樣品的內標,用甲醇配制成濃度為5 mg/L的標準溶液,于1～4 ℃下冷藏避光保存。

1.2.2 茶葉中農藥的提取 參考GB/T 23204-2008[17]和GB/T 23205-2008[18]方法,增加了浸泡提取步驟,稱取2 g茶葉樣品(精確到0.01 g),至80 mL離心管中,分別加入15 mL乙腈,浸泡1 h;15000 r/min均質提取1 min;低速離心機離心5 min(4200 r/min);將上清液轉至150 mL雞心瓶中;重復上述提取步驟,合并兩次提取上清液;旋轉蒸發(45 ℃,40 r/min)至約2 mL,待凈化。

1.2.3 茶葉樣品的凈化

1.2.3.1 LC-MS/MS測定凈化方法 活化Clearn-TPT柱(柱頂部填入約2 cm高的無水Na2SO4,5 mL乙腈-甲苯(3∶1,v/v)溶液淋洗兩次),棄去流出液,下接80 mL雞心瓶,放入固定架上待用;將1.2.1中待凈化濃縮提取液移至TPT柱中,2 mL乙腈-甲苯(3∶1,v/v)溶液洗滌雞心瓶3次,25 mL乙腈-甲苯(3∶1,v/v)洗脫;待所有液體收集完畢之后,取下雞心瓶;旋轉蒸發(45 ℃,70 r/min)至約0.5 mL;于35 ℃水浴中用氮氣吹干,殘渣用1 mL乙腈-0.1%甲酸水溶液(2∶8,v/v)超聲波溶解,經0.22 μm微孔過濾膜,濾液供LC-MS/MS測定。

1.2.3.2 GC-MS/MS測定凈化方法 活化Clearn-TPT柱(柱頂部填入約2 cm高的無水Na2SO4,5 mL乙腈-甲苯(3∶1,v/v)溶液淋洗兩次),棄去流出液,下接80 mL雞心瓶,放入固定架上待用;將1.2.1中待凈化濃縮提取液移至TPT柱中,2 mL乙腈-甲苯(3∶1,v/v)溶液洗滌雞心瓶3次,25 mL乙腈-甲苯(3∶1,v/v)洗脫;待所有液體收集完畢之后,取下雞心瓶;旋轉蒸發(45 ℃,70 r/min)至約0.5 mL,加入40 μL磷酸三苯酯,于35 ℃水浴中用氮氣吹干,殘渣加1 mL正已烷超聲波溶解,經0.22 μm微孔過濾膜,濾液供GC-MS/MS測定。

1.2.4 基質效應計算 對于基質效應的評價,本文采用了較為常用的相對響應值法:基質效應(%)=B/A×100[19],A為純溶劑中農藥的響應值;B為樣品基質中添加相同濃度農藥的響應值。

1.3 檢測條件

1.3.1 液相色譜-串聯質譜條件 色譜柱:Agilent ZORBAX SB-C18柱(100 mm×2.1 mm,3.5 μm);柱溫:40 ℃;進樣量:10 μL。流動相A:0.1%甲酸水溶液;流動相B:乙腈;流速為0.4 mL/min。梯度洗脫程序:0～3.0 min,1% B～30% B;3.0～6.0 min,30% B～40% B;6.0～9.0 min,40% B;9.0～15.0 min,40% B～60% B;15.0～19.0 min,60% B～99% B;19.0～23.0 min,99% B;23.0～23.01 min,99% B～1% B;23.01～27.0 min,1% B。電離模式:電噴霧離子化,正離子模式;霧化氣(氮氣)壓力:0.28 MPa;離子噴霧電壓:4000 V;干燥氣(氮氣)溫度:350 ℃;干燥氣流速:10 L/min;采集數據方式:多反應監測(MRM)。目標化合物的離子對、碰撞電壓等多反應監測(MRM)參數見表1。

表1 LC-MS/MS測定6種農藥的保留時間、離子對、碰撞能量、碎裂電壓Table 1 Retention times,ion pairs,collision energies and fragmentation of six pesticides for LC-MS/MS

1.3.2 氣相色譜-串聯質譜條件 色譜柱:Agilent DB-1701毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣為高純氦氣(純度99.999%);流速1.2 mL/min;柱溫起始溫度40 ℃,保持1 min,以30 ℃/min速率升溫到130 ℃,以5 ℃/min速率升溫到250 ℃,以10 ℃/min速率升溫到300 ℃,保持5 min;進樣方式為不分流,0.75 min后打開分流閥,進樣量1 μL,進樣口溫度290 ℃,傳輸線溫度280 ℃。電離模式:電子轟擊電離源(EI);離子源極性：正極性;電離能量:70 eV;離子源溫度:230 ℃;溶劑延遲時間:6 min;采集數據方式:多反應監測(MRM)。目標化合物的離子對、碰撞電壓等多反應監測(MRM)參數見表2。

表2 GC-MS/MS測定7種農藥的保留時間、離子對、碰撞能量Table 2 Retention times,ion pairs and collision energies of seven pesticides for GC-MS/MS

2 結果與分析

2.1 浸泡時間對農藥提取效率影響的考察

茶葉樣品中加入一定量乙腈溶劑,但在茶葉實際樣品檢測過程,由于樣品均為茶葉粉末,加入乙腈提取液后立即均質提取,無法充分提取農藥殘留,本文著重考察了本方法中GC-MS/MS測定的7種農藥在乙腈浸泡提取時間下農藥殘留的提取效率影響。

實驗中采用含有溴氰菊酯、樂果、高效氯氟氰菊酯、p,p′-滴滴伊、甲基嘧啶磷、腐霉利和噠螨靈的茶葉標準物質(編號:19184,白茶)做浸泡提取效率實驗,GC-MS/MS進行測定,對浸泡時間進行了優化。取7份陽性樣品,加入乙腈提取溶劑,分別在0、30、60、120、180、240 min和浸泡過夜12 h后均質提取,提取含量相對于0 min時的相對含量值和時間關系見圖1。結果可見,和未浸泡組比，乙腈浸泡30 min,溴氰菊酯、樂果、高效氯氟氰菊酯、甲基嘧啶磷和噠螨靈提取效率顯著提高;從30～60 min,除溴氰菊酯的提取效率與浸泡30 min提取效率相比有所下降,其他6種農藥在60 min提取效率均有明顯提高,除了溴氰菊酯和p,p′-滴滴伊,另外5種農藥在60 min時提取效率最高;茶葉樣品浸泡60 min均質提取與直接均質提取相比，茶葉陽性樣品中的7種農藥的含量均有較大提高,綜合考慮時間成本和提取效率,故本方法選擇乙腈浸泡60 min后均質提取。本文針對文章中研究的7種農藥提取效率進行優化,FAPAS能力驗證樣品中含有的農藥多為茶葉樣品常檢出農藥,所以針對樣品農藥的提取效率進行優化,對實際的檢測工作會有一定的指導意義。

2.2 LC-MS/MS測定樣品定容液的優化

在用LC-MS/MS對FAPAS茶葉標準物質(19184)進行測試的過程中發現,樣品定容液的選擇對LC-MS/MS測定農藥的色譜峰形有一定的影響,特別是對極性較大農藥的峰形有較大的影響。本文分別比較了乙腈-0.1%甲酸水溶液(2∶8,v/v)(a)、乙腈-0.1%甲酸水溶液(3∶2,v/v)(b)和乙腈-水(3∶2,v/v)(c)三種不同組成的定容液對啶蟲脒、樂果、吡蟲啉和滅多威這四種極性較大目標農藥分離效果,四種農藥的保留時間在2.90～4.07 min(見表1)。從圖2可見,定容液對保留時間在2.90～4.07 min的大極性農藥的峰形具有顯著的影響,使用乙腈-0.1%甲酸水溶液(3∶2,v/v)(b)和乙腈-水(3∶2,v/v)(c)的定容液溶解樣品時,保留時間在2.90～4.07 min出峰的農藥,峰形較差,出現分叉峰。分析原因,可能是溶劑效應造成,由于樣品溶劑為乙腈-0.1%甲酸水溶液(3∶2,v/v)和乙腈-水(3∶2,v/v)時溶劑的洗脫性太強,會導致樣品溶液與流動相混合時,一部分樣品隨樣品溶劑穿透分析柱(沒有疏水保留),另一部分樣品混入流動相,在分析柱上有保留,而本方法采用梯度洗脫的方式(見1.3.1梯度洗脫程序),在2.90～4.07 min流動相為乙腈-水(3∶7～2∶3,v/v)之間,定容液的極性與流動相極性相差較大,產生溶劑效應,可能是導致峰形變差的原因。而乙腈-0.1%甲酸水(2∶8,v/v)定容液極性與2.90～4.07 min流動相極性較接近,不會產生明顯的溶劑效應,樣品峰形良好,故本文方法LC-MS/MS選擇乙腈-0.1%甲酸水(2∶8,v/v)作為定容液。

圖2 4種農藥在3種不同定容液下MRM譜圖Fig.2 MRM chromatograms of four pesticides in three different solution注:a:定容液為乙腈-0.1%甲酸水溶液(2∶8,v/v);b:定容液為乙腈-0.1%甲酸水溶液(3∶2,v/v);c:定容液為乙腈-水(3∶2,v/v)。

2.3 基質效應

在GC-MS/MS和LC-MS/MS分析中,由于茶葉樣品基質成分的存在,基質效應的存在不可避免。本次研究配制了50 μg/kg的茶葉基質的基質標準溶液以及同濃度的溶劑標準溶液,分別對兩種儀器的基質效應進行考察。基質效應值在80%以下視為強基質抑制效應,在80%～120%之間視為弱基質效應,在120%以上視為強基質增加效應。通過實驗發現,兩臺儀器測定的農藥都表現出基質效應的影響,結果見圖3。由于基質效應明顯,實驗采用基質匹配校準曲線對樣品中的農藥進行了定量分析,用以抵消基質效應的影響。

圖3 兩種方法測定茶葉中農藥的基質效應評價Fig.3 Evaluation of matrix effects of pesticide in tea with the two methods

2.4 線性關系和定量限

按照1.2.1節方法處理陰性樣品,獲得空白基質樣品。取不同體積的5 mg/L的混合標準溶液,加入空白基質樣品中,按照1.2.3的定容方法分別定容液相色譜-串聯質譜和氣相色譜串聯質譜檢測樣品。液相色譜-串聯質譜結果顯示,滅多威在10～200 μg/L,腐霉利在50～200 μg/L,其余4種在5～100 μg/L范圍內呈現較好的線性關系,相關系數大于0.995(見表3),以信噪比(S/N)大于10且回收率和精密度較好的濃度點確定定量限(LOQ),其中滅多威為10 μg/kg,腐霉利為50 μg/kg,其余4種農藥的LOQ為5 μg/kg。圖4為空白基質中添加6種目標農藥的MRM譜圖,質量濃度均為各自的LOQ濃度。

表3 LC-MS/MS測定的6種農藥的標準曲線、線性范圍、相關系數、添加回收率、相對標準偏差和LOQTable 3 Linear equations,linear ranges,correlation coefficients(R2),recoveries,precisions (relative standard deviations,RSDs)and LOQs of six pesticides for LC-MS/MS

圖4 LC-MS/MS測定的6種農藥的基質標準溶液的MRM譜圖Fig.4 MRM chromatograms of a matrix-matched standard solution of six pesticides for LC-MS/MS

氣相色譜-串聯質譜結果顯示,溴氰菊酯在50～500 μg/kg,其余6種在10～300 μg/kg范圍內呈現較好的線性關系,相關系數大于0.996(見表4),以信噪比(S/N)大于10且回收率和精密度較好的濃度點確定定量限(LOQ),其中溴氰菊酯為50 μg/kg,樂果和高效氯氟氰菊酯為10 μg/kg,噠螨靈為5 μg/kg,其他3種農藥為0.5 μg/kg。圖5為空白基質中添加內標TPP和7種目標農藥的MRM譜圖,質量濃度均為各自的LOQ濃度。

表4 GC-MS/MS測定的7種農藥的標準曲線、線性范圍、相關系數、添加回收率、相對標準偏差和LOQTable 4 Linear equations,linear ranges,correlation coefficients(R2),recoveries,precisions (relative standard deviations,RSDs)and LOQs of seven pesticides for GC-MS/MS

圖5 GC-MS/MS測定的7種農藥及內標的基質標準溶液的MRM譜圖Fig.5 MRM chromatograms of a matrix-matched standard solution of seven pesticides and internal standards for GC-MS/MS

2.5 回收率和精密度

在空白茶葉樣品中分別添加10、50、100 μg/kg 3個濃度水平的目標物進行回收率實驗,液相色譜-串聯質譜方法的回收率和相對標準偏差(RSD)見表3;在陰性茶葉樣品中分別添加10、50、300 μg/kg 3個濃度水平的目標物進行回收率實驗,氣相色譜-串聯質譜方法的回收率和相對標準偏差(RSD)見表4。

其中,樂果、甲基嘧啶磷和腐霉利三種農藥GC-MS/MS和LC-MS/MS兩種測定方法均能檢測,對兩種測定方法檢測結果進行比對和偏差評估,檢測結果比較見表5。

表5 GC-MS/MS和LC-MS/MS共檢農藥結果比較Table 5 Comparison of the results of common detection of pesticides by GC-MS/MS and LC-MS/MS

從表5可以看出，兩種測定方法能夠共檢的3種農藥測定值的RSD均小于7.1%,說明兩種方法測定結果具有可比性和良好的一致性。

2.6 實際應用

將所建立的方法應用于FAPAS茶葉標準物質(19184)的能力測試,準確測定出本方法能夠測定的8種農藥并進行了準確定量,結果見表6。

表6 FAPAS茶葉標準物質(19184)能力測試結果Table 6 Test results for FAPAS tea standard substance(19184)

3 結論

本文方法對茶葉樣品在不同浸泡時間下農藥提取效率進行了比較,通過乙腈浸泡提取時間的優化,更加有效、完全地提取殘留的農藥,對本文中所研究的大部分農藥浸泡提取取得了較好的效果;通過對LC-MS/MS測定樣品定容液的優化,改善了極性較大農藥的峰形。本文建立了茶葉中啶蟲脒、樂果、吡蟲啉、滅多威、甲基嘧啶磷、腐霉利共6種農藥殘留的液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)測定方法和溴氰菊酯、樂果、高效氯氟氰菊酯、p,p′-滴滴伊、甲基嘧啶磷、腐霉利、噠螨靈共7種農藥殘留的氣相色譜-串聯質譜(GC-MS/MS)測定方法。該方法完善了茶葉中10種農藥殘留檢測方法針對實際樣品的檢測,將建立的方法應用于FAPAS茶葉標準物質(19184)的能力測試,對該測試含有的8種農藥進行了準確的定性和定量。雖然本次FAPAS驗證提供的茶葉樣品為白茶,但乙腈浸泡提取時間的優化主要針對茶葉里含有的農藥,不同茶葉在基質效應上會存在一定差異,但對農藥的提取效率是會有改善的。所以本文優化出的浸泡提取時間針對所研究的農藥,在不同茶葉中均會有一定的參考價值。