國內外紅茶菌研究進展

梅瀚杰,胡文鋒

(華南農業大學食品學院,廣東廣州 510642)

紅茶菌是一種傳統的民間發酵飲料,它的出現最早可以追溯到我國古代的秦漢時期,但關于紅茶菌的確切起源卻無從得知。相傳其最早出現在公元前220年我國的東北部地區,并且在公元414年傳入日本[1]。不僅在中國、韓國等東南亞地區,在歐洲中部和東部各國也有許多關于紅茶菌相關資料的流傳,各地的人們對紅茶菌有不同的叫法,在歐洲一些地方的人們把其稱之為酸茶酒,并將其當作清涼飲料來緩解消化不良和動脈硬化等癥狀[2]。

但究其本質,紅茶菌大多是以加入蔗糖的紅茶作為底物,進行微生物發酵而制成的。紅茶菌的母液中含有一部分的茶葉浸出物和發酵微生物及其代謝產物,包括:茶多酚、咖啡因、葡萄糖酸、乙酸、氨基酸、維生素、乙醇等。紅茶菌是一種對人體有多種保健功效的飲料,但由于人們對微生物的認知不足,在釀造過程中極容易污染雜菌,使得紅茶菌地位一直不高,但隨著純種培養、微生物分離等生物技術的進步,人們重新開始了對紅茶菌的研究。近年來我國對紅茶菌的研究大多都停留在對其成分的分析和抑菌功效的研究,但對紅茶菌的具體作用機理和生理生化作用研究仍然寥寥無幾。

國外對紅茶菌的研究大約始于20世紀初。從20世紀中期開始,許多關于紅茶菌對各種疾病的效果和作用已經有報道,有關紅茶菌的微生物組成及相互作用、發酵條件的優化、菌液成分分析、功能因子作用機理等方面的研究也陸續有報道。本文將從菌種組成、紅茶菌及細菌纖維工藝及應用和紅茶菌的益生功效進行闡述。

1 紅茶菌的菌種組成

紅茶菌是由醋酸菌和酵母菌混合發酵而成,個別的紅茶菌中也會添加一些乳酸菌。目前人們從紅茶菌中分離得到的醋酸菌有:薩克塔堤查仁桿菌(Tanticharoeniasakaeratensis)、羅旺醋酸桿菌(Acetobacterlovaniensis)、過氧化醋酸桿菌(Acetobacterperoxydans)、蒲桃醋酸桿菌(Acetobactersyzygii)、沖繩醋酸桿菌(Acetobacterokinawensis)、熱帶醋酸桿菌(Acetobactertropicalis)、醋化醋桿菌(Acetobacterliquefyaciens)、重氮營養醋桿菌(Acetobacterdiazotrophicus)、甲醇醋桿菌(Acetobactermethanolica)、蠟狀葡糖桿菌(Gluconobactercerinus)、氧化葡糖桿(Gluconobacteroxydans)、液化葡糖醋桿菌(Gluconacetobacterliquefaciens)、木葡糖醋桿菌(Gluconacetobacterxylinus)、溫馴葡糖醋菌(Gluconacetobacteroboediens)、糖精葡糖醋桿菌(Gluconacetobactersaccharivorans)、中間葡糖醋桿菌(Gluconacetobacterintermedius)、雷提庫斯葡糖醋桿菌(Gluconacetobacterrhaeticus)、漢遜德葡糖醋桿菌(Gluconacetobacterhansenii)。也有從紅茶菌的優勢菌群中分離到駒形桿菌屬(Komagataeibacterspp.)的報道[3]。

從紅茶菌中分離到的酵母菌包括:小捕有胞圓酵母(Torulasporamicroellipsoides)、博伊丁假絲酵母(Candidaboidinii)、克魯絲假絲酵母(CandiadaKrusei)、近平滑假絲酵母(CandidaParapsilosis)、葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、栗酒裂殖酵母(SchizosaccharomycespombeLinder)、異常畢赤酵母(Pichiaanomala)、膜醭畢赤酵母(Pichiamembranifaciens)、弗洛接合有孢圓酵母(Zygotorulasporaflorentina)、拜爾接合有孢圓酵母(Zygotorulasporabailli)、法爾皮有孢漢生酵母(Hanseniasporavalbyensis)、異常德克酵母(Dekkeraanomala)、布魯塞爾德克酵母(Dekkerabruxellensis)、漢遜德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)[4]。

各種紅茶菌發酵所用的菌種組成各不相同,一般都是由好幾種的醋酸菌與酵母菌共同發酵而成,少量紅茶菌中會加入一種或幾種乳酸菌。不同的菌種組成其發酵形成的母液當中的各成分含量也略有差別。在紅茶菌的發酵液中醋酸菌和酵母菌為共生關系,在發酵初期,酵母分解蔗糖為自身提供碳源,同時酵母也可以把分解蔗糖得到的果糖和葡萄糖進一步轉化為乙醇,為醋酸菌提供碳源和進一步氧化成乙酸的底物[4]。

2 紅茶菌及其細菌纖維相關研究進展

2.1 紅茶菌的制作工藝優化

目前國內大多數對紅茶菌飲料的研究都還只局限于搖瓶實驗,當在大型發酵罐中進行發酵的時候這些條件是否合適尚需商榷,并且國內針對發酵罐發酵各種參數優化的研究較少。任亮[30]在搖瓶實驗中確定了部分工藝條件后,對5 L發酵罐發酵工藝條件中的攪拌速度進行了優化,對紅茶菌的澄清條件和用噴霧干燥法制備紅茶菌粉劑的工藝參數進行了優化。Ahmad等[31]通過對能耗與開銷進行衡算,對4.5 L的自制發酵設備所發酵的紅茶菌進行了工藝條件優化。任二芳[32]研究了利用固定化共生發酵來制作紅茶菌飲料,在此基礎上對飲料制作工藝上的部分參數和固定化載體的選用和制備條件進行了優化。目前這些研究尚屬少數,且沒有涉及到一些產業化所需的相關發酵技術的優化,如高密度發酵和連續發酵所需的一些條件并無報道。

對紅茶菌的研究大多都是以其作為飲料的前提進行的,同時對其各項理化指標進行測試,少有將其作為一種非飲料食品進行工藝研究。孫永康等[33]則用紅茶菌和葡萄酒酵母對紅茶糖水進行發酵,研發一種紅茶菌酒并對一些工藝條件進行了優化。高燁等[34]將紅茶菌液摻入面團中,制成紅茶菌面包同時優化了工藝參數。梁進等[35]在熬糖的過程中加入紅茶菌液,制成具有紅茶菌液風味的芝麻酥并優化了其中的工藝條件。雖然往食品中添加紅茶菌使之成為一種紅茶菌風味食品是一種好的嘗試,但這些嘗試中忽略了食品加工條件對紅茶菌內各種功能因子的影響,如高溫、酶或其他基團的影響而使部分功能因子變性或失活,在完成成品后除了感官評定外還應檢測其中各功能因子含量變化,從而確定最優工藝條件。

2.2 紅茶菌細菌纖維的制作工藝優化

紅茶菌除了其母液的益生功效外,由其細菌發酵產生的一種細菌纖維近年來也開始備受關注。它是一種由細菌分泌到胞外的纖維素成分,醋酸菌為主要產生菌種,其中以木醋桿菌的產量較為突出。與普通植物纖維相比,細菌纖維具有多種優良的特性,如不含木質素和半纖維素、具有良好的吸水性、純度高、潔凈度高、良好的生物適應性和良好的機械強度,并且在自然界中可以降解而不會產生污染等特性[36-38]。同時其作為一種纖維素添加到食品中,可以充當膳食纖維的作用。在部分東南亞國家,細菌纖維素膜是一種深受大眾喜愛的風味食品[39]。

在生產細菌纖維的工藝優化上,國內外已有較多研究,如譚麗麗[40]用響應面法對紅茶菌發酵產細菌纖維中的溫度、接種量、種齡、培養液初始值等條件進行了優化。周艷等[41]運用純種培養紅茶菌來制備細菌纖維且對碳源、茶葉種類、茶葉用量、種齡、溫度和裝液量六個條件進行了優化。李昊燃[42]對紅茶菌中產纖維素的細菌進行了分離與鑒定,并對其純種發酵產生細菌纖維時不同的碳源、氮源、有機酸、磷鹽、溫度、初始pH和初始接種量等條件進行了優化。Goh等[43]研究了蔗糖濃度和發酵時長對細菌纖維的影響,發現在90 g/L蔗糖濃度下細菌纖維的產量最高,并且隨著發酵時間的延長細菌纖維的厚度和重量都有所增加。Jayabalan等[44]分析紅茶菌發酵過程中細菌纖維的生化性質,發現在細菌纖維中含有粗纖維、粗蛋白和硫氨酸,且其中的成分含量隨著發酵時間的延長而增多。任澤祺等[45]通過直接干燥法、冷凍干燥法和勻漿后干燥法三種方法對細菌纖維進行干燥,運用掃描電鏡和紅外光譜分析了不同烘干方法對細菌纖維的影響作用。程朝輝[46]嘗試了通過流加的方式進行細菌纖維的發酵生產,發現每隔1 d向三角瓶中流加20 mL新鮮液體培養基,細菌纖維素的產量最高,添加葡萄糖能較大程度提高細菌纖維產量,但隨著葡萄糖的添加,葡萄糖的轉化率也會降低。丁勇等[47]在發酵過程中添加透明質酸后發現,發酵產生的細菌纖維復水率和熱穩定性都有不同程度的提高,添加量為1 g/L時效果最佳。Stefan-Ovidiu Dima[48]對紅茶菌納米細菌纖維的提純方法做了優化等相關研究,認為納米細菌纖維在各個領域內具有廣闊的應用前景。

2.3 紅茶菌細菌纖維的應用

G S Murugesan等[49]研究了紅茶菌細菌纖維中的成分,干的細菌纖維其植酸酶活性達到23 IU/mg,通過向肉雞飼料中添加150 g/kg的細菌纖維明顯提高了肉雞的采食量、重量,并通過用細菌纖維喂食肉雞方式進行病理學實驗,結果發現對肝臟完全沒有損害且死亡數為零。

紅茶菌的細菌纖維對金屬離子具有吸附作用,在污染防治方面具有一定的應用前景。Stefanie Hopfe等[50]利用紅茶菌中微生物的降解作用將廢棄熒光粉中的稀土元素釋放出來,發現直接使用搖瓶培養的紅茶菌或其上清液稀土浸出率最高。S. Mamisahebei等[51]發現用FeCl3對紅茶菌的細菌纖維進行預處理后可以提高其生物吸附效果,他們對pH、不同離子處理等條件下細菌纖維對砷的吸附效果做了動力學研究,在pH6～8時,經FeCl3預處理后的細菌纖維對砷的吸附量為3.98×10-3mmol/g。Radojka Razmovski等[52]用動力學模型研究了紅茶菌細菌纖維對Cu2+和Cr(VI)的吸附作用,發現當pH分別為2.0和4.0時吸附效果最佳。魯敏[53]用響應面法優化了改性紅茶菌細菌纖維的制備工藝條件,研究了改性細菌纖維對Cd2+、Pb2+、Cu2+和Cr(VI)的吸附作用,通過動力學模型分析改性細菌纖維吸附的機理。賈丹等[54]以細菌纖維為載體,用靜態吸附法固定白腐真菌對染料污水進行處理,發現其對單一染料去除率高達98%以上,對混合染料廢水色度去除率達92%。隨著近年來環境問題越發得到重視,細菌纖維有望成為一種新型的治理水體污染的新材料?？梢試L試對重金屬污染的河流大量加入這種細菌纖維來吸附水體中的重金屬,同時細菌纖維中大量的醋酸菌在水體中存活,并且持續產生細菌纖維起到持續修復的作用,這種醋酸菌應是一種高產細菌纖維且抗逆性較好的菌種。

紅茶菌的細菌纖維可能成為一種新型材料。Czaja等[55]認為由醋酸桿菌產生的細菌纖維因其在化學穩定性、分子結構和機械強度上的優良特性,在未來材料的革新上擁有良好的應用前景。唐水佳[56]運用納米細菌纖維來制作生物醫用材料并進行了評價,通過在紡織基血管坯材上涂覆一層貫穿紡織基管坯材料的細菌纖維素抗凝血層,進行細菌纖維替代普通人造血管的可行性試驗。蔣燕光[57]用紅茶菌和木醋桿菌發酵產生納米細菌纖維對已有管狀材料進行改進,并進行了多項性能測試,同時對其作為人工血管的可行性做了分析,認為納米細菌纖維有作為人工血管的巨大潛力。Zhu等[58]發現紅茶菌細菌纖維對原代培養的神經鞘細胞具有良好的生物適應性,在小鼠體肌間隙中埋入細菌纖維后,數周后對比對照組小鼠在血細胞數量、血清生化指標和神經組織反應上沒有明顯的區別。

3 紅茶菌的益生功效

紅茶菌中的大部分益生功效都歸功于其中的一個重要功能因子D-葡糖糖二酸1,4-內酯(D-Saccharic acid 1,4-lactone,DSL)。DSL存在于大部分紅茶菌中,但也有少數紅茶菌,由于菌種、發酵條件等原因而檢測不到DSL。Bhattacharya等[59]用四氧嘧啶(alloxan,ALX)注射小鼠導致其糖尿病,同時檢測到其體內caspase-3表達量明顯提高,而喂食DSL的糖尿病小鼠可以抵抗糖尿病引起的各項體內血清學變化指標;DSL還可以通過降低腎臟細胞的氧化應激來達到保護腎臟的功能[60]。Rashid等[61]用喂食DSL的老鼠通過對脾臟注射ALX,研究DSL對脾臟細胞的減傷效果和作用機制,并認為DSL可作為一種改善糖尿病和調節脾臟失調的成分。

3.1 抗氧化性

Bhattacharya等[62]發現,紅茶菌的抗氧化性能比普通紅茶要高,同時喂食紅茶菌母液的小鼠在糖尿病癥狀上有所緩解,推測由于其具有的抗氧化能力使得DNA的斷裂和胰腺組織中caspase-3活化得以修復。Bhattacharya等[63]研究紅茶菌在小鼠體內對叔丁基過氧化氫(TBHP)的消除能力,同時研究了紅茶菌對其消除的分子機理。結果表明,紅茶菌里的某些物質可能通過作用于線粒體和其本身的抗氧化物質調節了體內的氧化應激,同時減輕肝臟細胞的凋零。Jayabalan等[64]用紅茶、綠茶、廢棄茶葉來發酵紅茶菌,發現隨著發酵時間的延長,母液中的總酚含量、對DPPH和超氧化物的清除能力、抑制羥基自由基介導的亞油酸的能力隨之提高,而羥自由基的清除能力和抗脂質過氧化的能力會減弱。推測其原因可能為一些酵母和細菌分泌的酶改變了其中一些抗氧化成分的構型。Malba?a等[65]用三種不同的菌(醋酸菌加接合屬酵母、醋酸菌加釀酒酵母、傳統紅茶菌發酵劑)分別對綠茶和紅茶進行發酵,考察對羥基和DPPH自由基的清除能力。結果發現,以傳統發酵劑發酵的綠茶和醋酸菌加接合屬酵母發酵的紅茶和綠茶的抗氧化性能最佳,并推測可能是由于不同菌種發酵導致其中所含的VC和有機酸含量不同。王冬梅等[25]對以蘆薈、玉米、紅薯糖漿為底物發酵的母液進行抗氧化性研究,發現蘆薈發酵的抗氧化性能最好,玉米次之;隨著發酵時間的延長,羥基清除能力和抗氧化值(AOV)也隨之增強,在4～6 d達到最大值,這和Jayabalan[61]和俸毅等[66]的研究結果一致;同時隨著發酵時間進一步的延長,抗氧化活性物質含量不再增加反而緩慢下降,且母液的抗氧化活性變化曲線與菌體生長曲線相一致。朱曉慶[67]在研究紅茶和綠茶發酵液抗氧化性時發現,發酵前6 d兩種發酵液總酚含量、還原力、對羥自由基和超氧陰離子的清除能力都在上升,且具有顯著的正相關性;隨著發酵時間的進一步延長,總酚含量、還原力、對羥自由基和超氧陰離子的清除能力均無明顯變化,在總酚含量、還原力和DPPH的清除能力上,綠茶發酵要優于紅茶發酵,而紅茶發酵在羥自由基和超氧陰離子清除能力上要明顯優于綠茶發酵。丁艷如等[68]對紅茶菌發酵過程中的各項指標,包括抗氧化能力(DPPH、羥自由基和超氧負離子清除率)進行檢測,認為還原力大小與抗氧化活性密切相關,且酚類可能是紅茶菌中抗氧化的關鍵物質。

Murugesan等[69]用紅茶、酶處理茶和紅茶菌對比研究三者對大白鼠肝臟損傷(損傷由四氯化碳引起)的治愈能力,發現三者都具有一定的損傷修復功能,但紅茶菌的修復能力最佳,推測原因可能是在紅茶菌發酵過程中產生的抗氧化物質導致的。Jayabalan等[70]以紅茶作為對比,研究紅茶菌對肝臟損傷(由黃曲霉毒素B1引起)的預防和抵抗作用,發現紅茶菌在預防和抵抗肝臟損傷的效果上明顯優于紅茶,其可能的機理是紅茶菌中的功能物質對肝臟有抗氧化和解毒的作用。Ibrahim[71]研究了紅茶菌對大白鼠肝腎病變(由CdCl2或γ射線引起)恢復能力的影響,結果表明紅茶菌可能通過抵抗由鉛或γ射線造成的氧化損傷來保護肝腎。Bhattacharya等[72]對離體鼠肝細胞用TBHP進行處理后,研究肝細胞凋零的數量、線粒體膜電位的變化、細胞色素C的釋放、caspases3、caspases9和凋亡酶激活因子(apoptotic protease activating factor-1,APAF-1)的激活等,發現紅茶菌可以有效地保護肝細胞免受氧化損傷,并維持其正常的生理;結果表明,紅茶菌是通過抗氧化活性物質的作用和抗氧化物質直接作用于線粒體,從而調節氧化應激來減少肝細胞的凋零。Abshenas等[73]研究紅茶菌對小鼠肝臟的保護作用,通過對各項組織病理學的指標評價,發現紅茶菌能有效保護肝臟免受對乙酰氨基酚的損害。雖然大部分的研究在實驗材料、試劑、方法等都各不相同,但幾乎所有的文章都得出同一個結論,即:紅茶菌的護肝作用都是由于其中的抗氧化成分對肝臟起了抗氧化或調節氧化應激等實現的,但也有認為DSL是護肝作用的關鍵成分[74]。針對紅茶菌生理作用的研究,在國外已經涌現出大量相關的論文,而國內在這方面的研究還比較欠缺,且目前尚未有文章對其具體的作用機理進行詳細報道,這方面可以作為紅茶菌研究的一個大方向。

3.2 抑菌活性

目前,大多數研究認為:紅茶菌中具有抑菌活性的主要成分為母液中的有機酸、多酚類物質抑菌蛋白。Talawat等[75]用多種茶(桑葉茶、日本煎茶、茉莉花茶、烏龍茶和紅茶)進行發酵,研究各個發酵液對病原菌(霍亂弧菌、傷寒沙門氏桿菌、綠濃桿菌、哈氏弧菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌和創傷弧菌)生長的抑制作用,發現紅茶發酵液的抑菌效果最好,并通過高效液相色譜分析發酵液成分,認為發酵液中的有機酸如琥珀酸和葡萄糖酸是抑菌的主要成分。Battikh等[76]用紅茶和綠茶進行發酵,研究發酵液對人體病原菌(表皮葡萄球菌、金黃色釀膿葡萄球菌、藤黃微球菌、大腸埃希氏菌、綠濃桿菌、金鼠傷寒沙門氏菌和單增李斯特菌)和真菌(念珠菌屬)的抑菌效果,發現綠茶發酵液的抑菌效果最好,特別在表皮葡萄球菌、藤黃微球菌和單增李斯特菌的抑菌效果上的表現較為突出;同時,從對念珠菌屬的抑制效果來看,其有潛力作為念珠菌屬的抑制物。李璐路[15]用紅茶、綠茶和普洱茶作為底物,用傳統紅茶菌菌膜進行發酵,研究三者發酵液的抑菌活性(指示菌為大腸桿菌和枯草芽孢桿菌),發現三種底物的抑菌效果相差不大,且隨著發酵的進行,發酵液的pH、細菌數量和總蛋白濃度提高,同時抑菌效果也有所增強;將紅茶菌中分離的菌種純培養后進行混合發酵,發現相比傳統發酵,對指示菌的抑菌效果更強,且調節pH至4.0(為排除pH對抑菌作用的影響)時抑菌效果明顯變弱但未完全喪失,推斷紅茶菌中的抑菌作用為抑菌蛋白和酸性物質共同作用的結果。Ali等[77]用一種印度家庭自釀的紅茶菌進行抑菌活性的研究,發現只有在25 ℃和pH4.5時才能對大腸埃希氏菌和沙門氏菌產生抑制,而對金黃色釀膿葡萄球菌毫無抑制作用,這與Battikh等[78]的結果并不相符,有可能是由于民間自釀的紅茶菌非純種發酵制成,以及發酵過程中的雜菌污染或菌種構成和發酵用料等差異導致的。Battikh等[79]用多種植物(百里香、檸檬過江藤、迷迭香、茴香和洋薄荷)提取液進行發酵,研究了各發酵液的抑菌活性,發現檸檬過江藤和茴香的發酵液對病原菌和念珠菌屬有明顯的抑菌作用,可以作為一種健康的發酵底物。謝俊杰等[76]研究了紅茶菌發酵過程中抗菌率(金黃色微球菌為指示菌)變化過程,結果顯示在發酵初期,隨著發酵的進行抗菌率逐漸提升,在達到最大值后開始緩慢下降。蔣立文[80]用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌,分別對茶水濃度、發酵液pH和分別經胰蛋白酶、過氧化氫酶、蛋白酶K處理的發酵透析液進行了抑菌效果的研究,發現茶葉濃度為1.0%(W/V)、紅茶菌發酵液及發酵液的透析液對指示菌生長均有抑制效果,經胰蛋白酶、蛋白酶處理的樣品液對指示菌抑制效果明顯降低,并認為紅茶菌發酵液中存在抑菌蛋白,且紅茶發酵液的抗菌作用是由酸性物質、抗菌蛋白、茶多酚協同作用的結果。

4 結論與展望

紅茶菌作為一種在世界上廣為流傳的健康飲料,其各種益生功效在近年已被廣泛提及,并有很多之前我們并沒有認識到的功效在不斷被發現。但由于紅茶菌發酵所用的菌種、底物和發酵條件等的不同,其母液中含有的成分也各不相同,導致每種紅茶菌的益生也不盡相同。同時通過紅茶菌發酵得到的細菌纖維,在未來新材料的應用上具有廣闊的前景。隨著納米技術的進步,納米細菌纖維由于其優異的特性可作為以后研究的方向。紅茶菌不僅僅是一種單純的飲料,其中的各種抗氧化物質和抑菌物質及各種功能因子都值得我們去關注。在以后的研究中可以嘗試分析和分離其中的功能性成分。該類物質不僅能起到抗氧化和抑菌的作用,對人體無毒無害,因而是一種有潛力的食品或食品添加劑。

國內現在對紅茶菌的研究仍然以食品方向為主,主要針對發酵條件等進行優化,對于紅茶菌在非食品領域方面如重金屬吸附等環境保護方面的研究仍相對不足,同時由于菌種的不固定,各種優化在不同菌種構成的紅茶菌中未必具有適用性,而且這些條件的優化都僅局限于搖瓶實驗,而在發酵罐發酵方面的優化少有提及。而國外針對紅茶菌的研究已經轉向紅茶菌的應用方面,如運用紅茶菌回收熒光廢料中的稀土元素和重金屬的吸附等環境保護方面。國內外對于紅茶菌中的細菌纖維的研究則基本集中于其纖維納米化和納米化細菌纖維在醫療方面的運用。

目前國內外尚未有人通過將大量的菌種進行混合搭配發酵確定最優菌種組成,在關于推薦發酵菌種方面也沒有任何報道。紅茶菌由于發酵時間較長,導致大批量的菌種搭配發酵實驗工作量巨大,可以嘗試通過微容器進行混合菌種的發酵,并以DSL或其他重要功能因子為指標,通過高通量篩選的方法,選擇出以該功能因子為主產物的最佳發酵菌種配比,為后續工業發酵的菌種選用提供推薦菌種;同時,還可以研究該菌種搭配下各菌種間相互作用對該種功能因子的影響和分子作用機理,為后續更好的指導發酵生產打下基礎。