Vps28基因多態性與EBV相關腫瘤易感性的關系

(青島大學，山東 青島 266003 1 附屬醫院檢驗科； 2 醫學院微生物學教研室)

EB病毒(EBV)是重要的DNA腫瘤病毒，與鼻咽癌、胃癌、淋巴瘤等多種腫瘤的發生相關[1-6]。其中90%以上的低分化鼻咽癌(NPC)組織中可檢測到EBV的存在，NPC發病存在家族聚集性、種族易感性及地域集中性。近年來，易感基因及病毒感染已逐步成為NPC發病的重要因素[7]，包括EBV基因在內的許多基因已被證實為NPC的易感基因，其多態性直接影響NPC的發病機制及病理類型[8-10]。Vps28是內吞體分選轉運復合體(ESCRT)的組成結構之一[11]，ESCRT在細胞分選及降解泛素化膜蛋白這一過程中發揮重要作用，使一些激素、生長因子及細胞因子受體在與配體結合后內化并被溶酶體降解，導致受體表達下調，從而在信號衰減中起著重要作用[12-13]。表皮生長因子與受體結合導致受體活化，誘發信號轉導，控制細胞的一系列功能，ESCRT在此過程中起到負向調節功能，其結構的變異可引起調節異常，導致腫瘤發生[14-16]。因此，探討Vps28在EBV相關腫瘤發生機制中的作用具有實踐指導意義。本文研究首次對EBV相關NPC(EBVaNPC)組織及EBV相關淋巴瘤(EBVaL)組織中Vps28基因rs2272658位點多態性進行檢測，以期明確其多態性與EBV相關腫瘤的發生是否存在相關性。

1 材料與方法

1.1 材料來源

采用原位雜交技術檢測105例NPC及136例淋巴瘤石蠟包埋組織切片中EBV編碼的小分子非多聚腺苷酸EBER1的轉錄表達[17]，篩選出93例EBVaNPC組織，12例EBV陰性NPC(EBV-negative nasopharyngeal carcinoma，EBVnNPC)組織，87例EBVaL組織，49例EBV陰性淋巴瘤(EBV-negative lymphoma，EBVnL)組織。同時選取我院健康體檢者100例作為正常對照組(NC組)。NC組均已排除各種感染、腫瘤及自身免疫病；各組間種族構成、年齡分布和性別構成在各病例組(包括鼻咽癌組及淋巴瘤組)與NC組間差異無統計學意義。

1.2 細胞DNA提取

NC組采集空腹靜脈血5 mL，EDTA抗凝，分離外周血單個核細胞。采用QIAamp DNA FFPE試劑盒(Qiagen，德國)并按說明書提取石蠟包埋腫瘤組織DNA。外周血單個核細胞DNA提取采用酚-氯仿-異戊醇法，4 ℃保存備用。

1.3 Vps28基因rs2272658位點多態性的檢測

利用AssayDesigner 3.1軟件設計Vps28基因rs2272658位點的反應引物，引物序列如下：上游引物：5′-ACGTTGGATGAACTGTTCCTGAGGCAC-TCC-3′；下游引物：5′-ACGTTGGATGTAGAGCC-CAGAGTGCTACC-3′。根據實驗體系依次進行PCR、SAP純化反應及單堿基延伸反應，使用Sequenom公司的MassArray系統進行飛行質譜實驗，通過分析軟件MassArrayTyper 4.0進行處理，從而得到Vps28基因rs2272658位點在所有標本中的SNP分型。

1.4 統計學處理

采用SPSS 21.0統計軟件對實驗數據進行分析。采用χ2檢驗分析比較基因型和等位基因頻率的分布差異。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組織中Vps28基因rs2272658位點多態性檢測結果

在隱性模型當中，EBVaNPC組的TT基因型頻率高于NC組(OR=2.07，95%CI=1.16～3.68，χ2=6.21，P<0.05)。EBVaNPC組的T等位基因頻率明顯高于NC組(OR=1.75，95%CI=1.13～2.72，χ2=6.26，P<0.05)。表明TT基因型為EBVaNPC的致病基因型，而T等位基因為EBVaNPC的危險因子。

EBVaNPC組中T等位基因及TT基因型頻率均高于EBVnNPC組(OR=5.07，95%CI=2.08～12.36，χ2=14.71，P<0.01；OR=41.60，95%CI=3.88～447.56，χ2=18.79，P<0.01)。在隱性的模型中，EBVaNPC組中TT基因型的頻率明顯高于EBVnNPC組(OR=13.95，95%CI=1.37～112.53，χ2=9.63，P<0.01)。在顯性模型中，EBVaNPC組CC基因型頻率明顯低于EBVnNPC組(OR=8.80，95%CI=1.962～39.47,χ2=10.60，P<0.01)。表明相對于EBVnNPC組，TT基因型以及T等位基因為EBVaNPC的危險因子。見表1。

2.2 淋巴瘤組織中Vps28基因rs2272658位點多態性檢測結果

EBVaL與EBVnL以及NC組間Vps28基因rs2272658位點的基因型分布無統計學差異(P>0.05)；EBVaL與EBVnL組及EBVaL與NC組間T等位基因分布均無統計學差異(均P>0.05)。結果見表2。

3 討 論

ESCRT是一類與腫瘤、神經病變性及感染性疾病關系密切的保守蛋白質，參與細胞增殖、分化、信號轉導等多種生命活動的調控，與多種疾病的發生密切相關[18-19]，因此ESCRT的組件受損會引起一系列的疾病。4種蛋白Vps23、Vps28、Vps37、Mvb12構成了復合體ESCRT-Ⅰ，ESCRT-0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ以及Vps4 5個復合體進一步組成了完整的ESCRT。

表1 EBVaNPC組、EBVnNPC組及NC組的Vps28基因rs2272658位點多態性的分布(例(χ/%))

表2EBVaL組、EBVnL組及NC組的Vps28基因rs2272658位點多態性的分布(例(χ/%))

組別基因型頻率CCCTTT等位基因頻率CTNC組11(11.00)51(51.00)38(38.00)73(36.50)127(63.50)EBVaL組10(11.49)43(49.43)34(39.08)63(36.21)111(63.79)EBVnL組8(16.32)19(38.78)22(44.90)35(35.71)63(64.29)

研究證明，ESCRT能夠參與病毒的出芽過程，調控細胞自噬。BLECK等[20]研究證實，ESCRT通路能夠在HIV-I病毒顆粒組裝時被聚集，并且參與新生病毒質膜分裂的過程，進而參與病毒的復制。有研究結果顯示，DNA包膜病毒如皰疹病毒和桿狀病毒等的出芽釋放也依賴于宿主細胞的ESCRT系統，ESCRT可以協助EBV調整核膜結構，促進核酸釋放[21]。

ESCRT-I中的Vps23，又稱為Tsg101，是一種腫瘤易感基因，能夠促進細胞分裂和增殖，加快細胞周期進程，促進體內病毒的運輸，在人類多種腫瘤中高度表達，檢測Tsg101可用于評估腫瘤惡性程度并為靶向治療提供可能的位點[22]。CHUA等[23]報道，Tsg101能夠與病毒裂解激活酶Rta反應，促進EBV的晚期基因激活，完成EBV的生產性裂解循環，具有Tsg101缺陷的細胞不能表達晚期病毒蛋白，導致病毒顆粒的產量降低。STUCHELL等[24]研究發現，Tsg101蛋白發生突變之后由于不能夠與Vps28蛋白連接，因而使細胞具備了抑制HIV出芽的能力。因此可以推斷，Vps28與腫瘤易感基因Tsg101關系較為密切，是病毒復制及其信號通路中不可缺少的一部分。Vps28的基因多態性亦有可能引起Tsg101功能的改變，進而影響病毒相關腫瘤的易感性。

WAGENAAR等[25]研究表明，在Vps28缺失的條件下，肺腺癌細胞系A549對miR21抑制劑的攝取作用大大增強，侵襲能力明顯減弱，增殖速度降低。上述研究結果提示，Vps28與miR21在腫瘤中的作用密切相關，Vps28的基因多態性在腫瘤發生發展過程中起到了重要的輔助作用。

本研究首次對Vps28基因rs2272658位點多態性與EBV相關腫瘤的易感性進行探討。實驗結果表明，EBVaNPC中TT基因型頻率和T等位基因頻率明顯高于EBVnNPC組及NC組，提示T等位基因可能是EBVaNPC發病的危險因子，攜帶T等位基因可能會增加EBVaNPC的易感性。由此可以推斷Vps28基因rs2272658位點多態性與EBVaNPC具有相關性。

本研究結果顯示，EBVaL、EBVnL及NC組間Vps28基因rs2272658位點多態性分布無統計學差異，表明該位點的多態性與此類疾病無明顯相關性。在EBV的生命周期中，口咽部和唾液腺等的上皮組織通常是病毒復制的主要部位[26-30]，而淋巴瘤為間葉組織中造血組織腫瘤，鑒于兩者組織來源不同，EBV感染的潛伏類型也不盡相同，因此Vps28基因rs2272658位點多態性與EBV的相互影響更易于發生在上皮細胞的腫瘤中[31-32]。

總之，本研究結果提示Vps28基因rs2272658位點基因型頻率、等位基因頻率與EBVaNPC易感性有關，攜帶T等位基因會增加患EBVaNPC的風險，Vps28基因rs2272658位點多態性與淋巴瘤組織中EBV感染無相關性。Vps28基因rs2272658位點多態性與EBV感染及有關信號通路中的相互關系還有待更進一步的研究。