仿生金線蓮有效成分含量及影響因素研究

楊開興

（福建省邵武市二都國有林場，福建 邵武 354000）

金線蓮[Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl.]，為多年生蘭科開唇蘭屬名貴中草藥，素有 “藥王”、“金草”、“鳥人參”等美稱。廣泛分布于熱帶亞洲至大洋洲，我國福建、臺灣、廣東、廣西均有野生品種，其中以福建金線蓮的藥用品質最高[1-2]。現代醫學證明，金線蓮鎮痛作用比嗎啡強10-40倍[3]，同時具有抗衰老、提高機體免疫力等的藥用價值[4]。研究顯示，上述藥用品質主要與黃酮類、糖類、氨基酸等藥用成分及其合成酶活性密切相關[5-7]。

野生金線蓮目前已經瀕臨滅絕，商品金線蓮大都源自大棚種植甚至組織培養[8-9]。人工栽培金線蓮一定程度滿足了市場對金線蓮數量的需求，但其療效和野生金線蓮存在較大差距，不符合傳統中藥的“道地性”要求[10-11]。如何提高人工栽培金線蓮藥用質量成為金線蓮種植亟需解決的問題。

仿生態種植是將植物體種植于原生或類似生境中，使其獲得野生種某些特性的一種人工栽培方式[12]。中藥材品質與生長環境密切相關，環境條件不僅影響其有效成分含量，而且影響成分之間的比例。因此，仿生態栽培對于提高中藥材的藥用品質效果良好，已有多種中草藥的仿生態種植獲得成功[13]。然而迄今為止，金線蓮仿生態栽培還處于起步階段。仿生態栽培過程中，金線蓮各種藥用成分及其相關酶活性發生何1種變化以及造成這些變化的原因也未可知，影響了金線蓮仿生栽培方式的推廣應用。

鑒于此，本研究將金線蓮組培苗進行仿生態種植。監測其仿生栽培過程中金線蓮總多糖、總黃酮、游離氨基酸含量以及PAL酶活性的變化，同時比較仿生金線蓮上述指標與野生金線蓮之間的差異，結合期間環境因子的變化，探討影響仿生金線蓮藥用成分變化的主要因素，為金線蓮仿生栽培提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 仿生樣地設置及樣品采集

依據野生金線蓮生長環境，選擇類似植被群落和土壤理化性質的天然闊葉林地為仿生金線蓮種植樣地，每塊樣地大小約為5 m×5 m，共設置5塊樣地。樣地位于福建省邵武市二都伐木場林地。

2016年4月份栽培組培金線蓮苗（組培苗購置于市場，苗齡為3個月），除模擬降雨噴灌及適度（30%）遮陰，無其他人工干預。于當年 5、6、7.5、9、12月及次年2月共采集6批次金線蓮樣品，每批次每塊樣地的采集量約為200 g左右，迅速運回實驗室。同時搜集野生福建金線蓮（生長1年左右，共收集野生樣品100 g）和成品大棚種植的福建金線蓮（生長8個月，共250 g）樣品。部分新鮮樣品直接用于PAL酶活性的測定，其余樣品烘干、研磨后用于金線蓮多糖、氨基酸、黃酮含量的測定，每份樣品作3次重復。

1.2 環境參數、有效成分和PAL酶活性測定

金線蓮多糖含量采用熱水浸提-苯酚-硫酸法測定[14]；總黃酮含量采用超聲提取-紫外分光光度法測定[15]；游離氨基酸含量采用超聲提取-茚三酮顯色法測定[16]；試劑盒法（ELISA測定試劑盒）測定PAL酶活性[11]。

每天早上9：00和下午3：00對仿生金線蓮種植林地及野生金線蓮林地的光照、空氣濕度、空氣溫度、土壤濕度和土壤溫度進行測量記錄，計算日及月平均環境參數變化。

1.3 數據分析處理

環境參數分別按樣地編號作日平均后再按月份取平均值，多糖、氨基酸、黃酮和PAL酶活性則按批次分別取均值。后用Excel和SPSS軟件對所得數據進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 仿生樣地環境參數變化特征

試驗樣地空氣濕度于49.7%~97.9%之間變化，而同一時期土壤濕度則明顯小于空氣濕度（19.8%~30.4%）（圖1）。不同地塊空氣溫度變化較為穩定（18.1-33.7℃），土壤溫度則較為接近于空氣溫度，均值為16.8-29.0℃。同一時間不同地塊光照強度存在較大差異，其中4、5、6月差值相對很小，而7、8月光照強度差值增大，可能與夏季太陽高度角有關。總體上，樣地間環境參數比較接近。野生金線蓮林地8月份環境參數（光照度：800 lx、土壤濕度：25% 、土壤溫度：15.7 ℃、空氣濕度：78%、空氣溫度：18.7℃）與同月份仿生樣地環境參數接近，說明試驗樣地的微域氣候基本符合仿生態種植標準。

圖1 樣地環境因子時間變化Figure 1 Type place environment factor time variation

2.2 有效成分及PAL酶活性的變化

2.2.1 多糖總量

多糖在植物合成代謝較旺盛時大量累積，并在逆境中消耗[17]。數據顯示（圖2），仿生金線蓮多糖含量變化幅度較小，略有增加，最終接近野生金線蓮中的含量（20.6%）。其變化可能與金線蓮生長周期有關。移栽時為春夏之交（0-3個月），金線蓮營養生長旺盛，因此多糖類物質累積。此后夏秋季（4-6個月）的干旱和高溫對多糖累積不利，造成其含量下降。由于金線蓮每年10月份左右開花，因此8-10個月期間多糖含量的再次上升和下降可能與金線蓮生殖生長有關。

圖2 金線蓮的有效成分含量測定結果Figure 2 Anoectochilus roxburghii's effective component content determination result

2.2.2 游離氨基酸總量

金線蓮中游離氨基酸含量變化大致表現為先下降后上升，并最終穩定在1.0%左右，與野生植株游離氨基酸含量十分近似（1.0%）。最初游離氨基酸含量較高可能與組培苗的基質營養較為豐富有關，移栽于自然環境后，原先累積的氨基酸被逐漸消耗，因此含量下降。由于缺水及低溫會引起植物體內氨基酸含量的增加[18]。因此3個月后氨基酸含量上升可能與栽培林區夏秋季雨量減少密切相關。

2.2.3 PAL酶活性

PAL酶是植物黃酮類化合物產生過程中關鍵的酶類，生存逆境會誘導編碼PAL酶的mRNA量增加，從而提高PAL酶活性[19-20]。仿生栽培過程中金線蓮的PAL酶活性發生了大幅度變化。移栽一個月后金線蓮PAL酶活性大幅度上升，可能由于生長環境的巨大變化，刺激了PAL酶活性的增長。隨著幼苗對自然環境的適應，在其后的5個月間，PAL酶活性逐漸下降。6個月后，PAL酶活性再次大幅度提升，以應對秋冬季降雨量和溫度的下降。由于大部分時期仿生金線蓮PAL酶活性大部分高于野生金線蓮（37.5%），說明外界環境條件變化對PAL酶活性影響較大。

2.2.4 總黃酮含量

黃酮屬于植物體次生化合物，具有調節生長、避免紫外線損傷等作用[21]。仿生栽培頭1個月，總黃酮含量先急劇減少，表明植物體不適應環境，不斷消耗原先累積的物質。此后穩步攀升，至5個月到達頂峰，略低于野生金線蓮（4.0%）。說明這一時期植物體對環境逐步適應，隨著初級代謝的增強，次生代謝物也逐步累積。5個月后其含量緩慢下降，表明秋冬季節轉變或生殖生長促使植物體內次生代謝物逐步消耗。

2.3 有效成分、PAL酶活性與環境因子的相關分析

相關分析表明（表1），有效成分、PAL酶活性與大部分環境參數相關性并不顯著，說明環境條件對植物生理生化的影響較為復雜。僅PAL酶活性與空氣濕度和空氣溫度相關性達到極顯著和顯著水平，r值分別為0.993和-0.969。此外土壤溫度和光照強度也可能是影響PAL酶活性變化的重要因素。空氣濕度與降雨量密切相關，表明長時間降雨促進PAL酶活性提升；空氣溫度與季節變化有關，說明長時間的高溫天氣抑制了PAL酶活性。

表1 仿生態栽培金線蓮中有效成分與環境因子相關性分析Table1 Imitates the ecology to cultivate in anoectochilus roxburghii the effective component and the environment factor relevance analysis

3 討論

金線蓮仿生栽培面臨較為復雜的自然環境，其生理生化活性變化是多因素綜合作用的結果。本研究表明，3種活性成分以多糖的累積量最高，波動幅度最小。這可能與多糖為重要的初生代謝產物，為金線蓮提供生存所需的物質和能量有關[12]。黃酮總量超過了游離氨基酸含量，說明黃酮類是金線蓮重要的次生物質，以應對環境變化。相比多糖和氨基酸，栽培過程中黃酮含量變化幅度最大，說明仿生金線蓮的黃酮含量容易受環境因素影響。研究顯示，初生代謝在金線蓮生理活動中占據主導地位，而次生代謝則受環境調控明顯。因此，金線蓮仿生栽培過程不僅要重視生物量增長，更應密切關注環境變化帶來的活性成分的累積變化，從而提高金線蓮的藥用品質。

分析顯示，多糖、黃酮和游離氨基酸等總量指標對環境條件的變化不敏感。鑒于上述指標均包含多種化學成分，未來應就各總量指標的具體組分展開更為細致的研究，揭示它們與環境因子之間的有機聯系。。其中，PAL酶活性指標對外界條件變化較為敏感，說明外界條件變化直接影響了酶活性，但其活性與黃酮累積量之間的關系并不明確。表明金線蓮仿生栽培面臨較為復雜的自然環境，黃酮類化合物的累積是合成代謝與分解代謝綜合作用的結果。將來應就黃酮類代謝通路上更多的酶活性進行研究。

本研究中，隨著栽培時間的增加，仿生栽培金線蓮黃酮、游離氨基酸和多糖含量均表現出一定的變化規律，最終它們的含量趨近于野生金線蓮。它們含量的變化與季節轉換和植物體生物學特性有關。其中，值得關注的時間節點為金線蓮移栽5-6個月左右，即9-10月份，植物體總黃酮和游離氨基酸含量達到當年的最大水平。這一結論可為仿生栽培金線蓮最佳采收時間提供參考。由于金線蓮為多年生植物，仿生栽培金線蓮最佳采收時間為當年或次年9-10月份，符合植物生長規律。具體適宜時間還需進一步權衡，達到藥物品質和收益的最大化。