子宮內膜癌患者腫瘤組織和血清中SOX1和VIM啟動子的甲基化檢測及其臨床意義

舒新紅 范紅莉 李小燕

子宮內膜癌（endometrial carcinoma，EC）是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，絕大多數為雌激素依賴型（即Ⅰ型）子宮內膜樣腺癌［1］。國內外研究均表明［2-3］，EC的發病率不斷增長，且趨于年輕化，美國等發達國家EC發病率高居婦科惡性腫瘤首位，中國EC的總死亡率居婦科惡性腫瘤第二位。表觀遺傳學改變在腫瘤的形成過程中起重要作用，尤其是基因啟動子區異常甲基化，可造成抑癌基因沉默，從而促進腫瘤的發生、發展［4］。性別決定區Y框蛋白1（sex determining region Y-box 1，SOX1）屬于SOX家族，具有調控胚胎神經系統和晶狀體發育的作用。研究發現［5］，SOX1在多種腫瘤中呈現低表達，且發現SOX1基因啟動子區發生甲基化。波形蛋白（vimentin，VIM）屬于中間絲家族，主要在結締組織中表達，作用在于維持細胞形態、保持細胞質完整等。研究發現，VIM基因啟動子區異常甲基化與乳腺癌、宮頸癌等多種癌癥有關，但其在EC患者血清中的甲基化情況還未見報道［6］。本研究采用甲基化特異性PCR（methylation specific PCR，MSP）技術檢測EC患者血清中SOX1、VIM基因啟動子的甲基化狀態，并探討其對EC的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇英山縣人民醫院2013年7月至2015年12月收治的120例EC患者為觀察組，年齡33～76歲，平均（52.62±12.24）歲，平均體質指數（26.86±2.53）kg/m2，其中絕經期患者38例，所有患者均經病理檢查確診，且術前無進行放化療及激素治療。根據2009年國際婦產科聯盟的手術病理分期標準［7］：Ⅰ～Ⅱ級104例，Ⅲ～Ⅳ級16例；根據世界衛生組織EC組織分類標準［8］：子宮內膜樣腺癌83例，漿液性腺癌23例，透明細胞腺癌14例；子宮肌層浸潤深度＜1/2者79例，浸潤深度≥1/2者41例；淋巴結轉移者25例，無淋巴結轉移者95例。另選擇同期于本院接受治療的50例功能性子宮出血患者作為對照組，年齡35～70歲，平均（50.38±10.96）歲，平均體質指數（27.35±1.78）kg/m2，其中絕經15例。觀察組與對照組的年齡、絕經情況、體質指數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。所選受試者均排除心、肝、腎等器質性病變者。所有受試者均簽署知情同意書，本研究經醫院倫理委員會審核批準。

1.2 試劑和儀器

OIAamp DNA Blood Mini Kit購自德國Qiagen公司；QIAamp DNA Mini Kit購自德國Qiagen公司；EZ DNA Methylation-Gold Kit購自美國Zymo Research公司；Zymo Taq DNA Polymerase購自美國Zymo Research公司；SOX1，VIM基因啟動子甲基化引物購自上海生工生物工程有限公司；溴化乙錠（EB）購自美國Sigma-Aldrich公司；瓊脂糖購自西班牙Gene公司；微量移液器購自德國Eppendorf公司；離心機購自美國貝克曼庫爾特公司，型號：Allegra X-12；斡旋震蕩器購自廣州儀科實驗室技術有限公司；PCR儀購自德國Eppendorf公司；蛋白核酸測定儀購自Gene Quant公司；紫外燈箱購自美國Coleparmer公司；凝膠電泳圖像分析系統購自上海復日科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 血液采集

采集受試者清晨空腹5 mL肘靜脈血液，3 000 r/min離心5 min，取上清液分裝于2 mL EP管中，保存于-80℃冰箱備用。

1.3.2 血清DNA的提取

分別用OIAamp DNA Blood Mini Kit和QIAamp DNA Mini Kit提取血清DNA和腫瘤組織DNA，實驗操作方法嚴格按照說明書進行。用蛋白核酸測定儀測定DNA濃度及純度，OD260/OD280在1.6～1.8之間的DNA樣品用于后續實驗。

1.3.3 DNA重亞硫酸鹽修飾

用EZ DNA Methylation-Gold Kit對1 μg DNA進行重亞硫酸鹽修飾。向PCR管中分別加入130 μL CT Conversion Reagent，20 μL DNA樣品，震蕩混勻，瞬時離心；將PCR管放入PCR儀中98℃10 min，64℃2.5 h，4℃保存；向PCR管中加入600 μL M-洗滌緩沖液，充分混勻；將混合溶液轉移至套有2 mL收集管的Zymo-Spin TM IC柱中，離心30 s；依次向柱內加入100 μL M-Wash，200 μL M-脫磺化，200 μL M-Wash，10 μL M-Elution緩沖液，每次緩沖液加入后離心30 s；所得濾液即為修飾好的DNA，立即使用或于-20℃冰箱中保存。

1.3.4 SOX1、VIM基因啟動子甲基化的檢測

用SOX1和VIM基因啟動子甲基化引物擴增修飾后的DNA，配制25 μL MSP反應體系：12.5 μL Premix Taq，1 μL修飾DNA，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物和10.5 μL DNase-free H2O。MSP反應條件：95℃預變性5 min；95℃30 s，58℃40 s，72℃40 s，45個循環；72℃延伸10 min；4℃保存。最后用2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈箱中曝光，用凝膠電泳圖像分析系統采集并分析圖像數據，見表1。

表1 SOX1和VIM基因啟動子甲基化引物Table 1 Methylation primers for the promoters of SOX1 and VIM genes

1.3.5 結果評定

甲基化引物擴增結果陽性，非甲基化引物陰性代表“完全甲基化”；甲基化引物擴增結果陽性，非甲基化引物陽性代表“部分甲基化”；甲基化引物擴增結果陰性，非甲基化引物陽性代表“未甲基化”。“完全甲基化”與“部分甲基化”認定為甲基化陽性，“未甲基化”認定為甲基化陰性。甲基化陽性率=甲基化陽性數/總例數×100%。

1.4 數據統計分析

本研究利用SPSS 20.0統計軟件進行數據處理，計量資料采用表示，用t檢驗；計數資料用“率”描述，用χ2檢驗，并對單獨及聯合檢測的靈敏度、特異度進行分析。當P＜0.05時，差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EC患者SOX1基因啟動子甲基化情況

EC患者血清SOX1基因啟動子甲基化率為71.67%，對照組血清SOX1基因啟動子甲基化率為10.00%，2組間的差異具有統計學意義（P＜0.05）。EC患者腫瘤組織SOX1基因啟動子甲基化率為95.83%，對照組腫瘤組織SOX1基因啟動子甲基化率為2.00%，2組間的差異具有統計學意義（P＜0.05），見圖1和表2。

2.2 EC患者VIM基因啟動子甲基化情況

EC患者血清VIM基因啟動子甲基化率為60.83%，對照組血清VIM基因啟動子甲基化率為12.00%，2組間的差異具有統計學意義（P＜0.05）。EC患者腫瘤組織VIM基因啟動子甲基化率為94.17%，對照組腫瘤組織SOX1基因啟動子甲基化率為4.00%，2組間的差異具有統計學意義（P＜0.05），見圖2和表3。

圖1 SOX1基因啟動子甲基化MSP檢測結果Figure 1 The promoter of SOX1 gene MSP detection results

2.3 血清SOX1、VIM基因啟動子甲基化與EC患者臨床病理特征的關系

血清SOX1、VIM基因啟動子甲基化水平與EC患者的病理分期、子宮肌層浸潤深度、淋巴結轉移情況有關（P＜0.05），與HCC患者的年齡、腫瘤類型無關（P＞0.05），見表4。

表2 血清及腫瘤組織SOX1基因啟動子甲基化陽性數目統計Table 2 Statistics of methylation positivity of the promoter of SOX1 gene in serum and tumor tissues

圖2 VIM基因啟動子甲基化MSP檢測結果Figure 2 The promoter of VIM gene MSP detection results

2.4 血清SOX1、VIM基因啟動子甲基化對EC的診斷價值

血清SOX1、VIM啟動子甲基化單獨及聯合診斷的靈敏度依次為71.67%、60.83%、81.67%，特異度依次為90.00%、88.00%、84.00%，準確度依次為77.06%、68.82%、86.47%。與SOX1、VIM單獨診斷比較，聯合診斷的靈敏度、準確度均顯著升高（P＜0.05）；不同診斷方式的特異度比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表5。

表3 血清及腫瘤組織VIM基因啟動子甲基化陽性數目統計Table 3 Statistics of methylation positivity of the promoter of VIM gene in serum and tumor tissues

表4 血清SOX1、VIM基因啟動子甲基化情況與EC患者臨床病理特征的關系Table 4 Relationship between serum of the promoter of SOX1 and VIM methylation and clinicopathological characteristics of EC patients

表5 血清SOX1、VIM啟動子甲基化單獨或聯合診斷結果對比Table 5 Comparison of diagnostic results of serum of the promoter of SOX1 and VIM methylation alone or in combination

3 討論

EC多發于中老年女性，在西方發達國家較為多發，在中國的發病率逐年上升［9］。目前關于EC的具體發病機制尚未明確，大部分研究者認為是遺傳信息改變，內分泌因素及外界環境因素共同作用的結果［10］。雖然早期子宮內膜樣腺癌（Ⅰ型）的預后比較好，然而晚期，復發性及Ⅱ型子宮內膜癌的預后極差，平均生存時間僅1年，及時治療仍不能使中位生存時間提高。臨床診斷EC的方法主要有診斷性刮宮、B超、電子計算機斷層掃描（computed tomography，CT）、核磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、淋巴造影等。但B超難以分辨早期EC和子宮內膜炎；CT、MRI和淋巴造影步驟繁瑣，費用昂貴，準確率僅為70%；診斷性刮宮不能確切評估病變范圍，且可能會有漏診或過度診斷［11-12］。因此，尋找經濟高效的腫瘤標志物是目前醫學領域研究的方向。

本研究對EC患者血清SOX1基因啟動子甲基化率進行檢測，結果顯示，EC患者血清SOX1基因啟動子甲基化率較對照組女性顯著升高，EC患者腫瘤組織SOX1基因啟動子甲基化率顯著高于對照組。DNA甲基化是一種常見的表觀遺傳學改變，其可抑制靶基因的表達，進而參與腫瘤的形成過程。SOX1蛋白在多種腫瘤中呈現低表達，SOX1基因啟動子甲基化功能近年頗受關注。劉志禮等［5］研究發現，宮頸癌組織中SOX1水平較良性組織明顯降低，SOX1基因在宮頸鱗癌中呈現出高甲基化水平，甲基化率達81.5%，與本研究結果一致，說明EC患者血清SOX1啟動子高甲基化水平，可用于EC的臨床診斷。血清及腫瘤組織SOX1基因啟動子甲基化水平與EC患者的病理分期、子宮肌層浸潤深度、淋巴結轉移情況有關，說明血清SOX1基因啟動子甲基化水平越高，EC患者病情越嚴重，故血清SOX1啟動子甲基化水平可一定程度上反映出EC患者病情的嚴重程度，其具體機制可能是SOX1基因啟動子高甲基化而造成SOX1表達降低，對腫瘤細胞局部侵襲和遠處轉移的影響。

本研究發現，EC患者血清VIM基因啟動子甲基化率顯著高于對照組女性，EC患者腫瘤組織VIM基因啟動子甲基化率顯著高于對照組。VIM為間充質細胞的特異性標志物，在細胞粘附、微管組裝和骨架重塑過程中發揮重要作用。有研究發現［6，13-14］，VIM與上皮-間質轉化過程有關，而上皮-間質轉化過程是癌細胞侵襲、轉移的重要過程；VIM還可影響細胞凋亡，其在胞質內能與p53蛋白結合，影響p53的入核過程，從而促進細胞凋亡。以上研究結果說明VIM高表達能夠抑制癌細胞侵襲、轉移，促進癌細胞凋亡，而EC患者血清及腫瘤組織VIM啟動子高甲基化水平，導致VIM表達降低，可能利于癌細胞增殖、侵襲和轉移。與患者臨床病理特征關系結果顯示，血清VIM基因啟動子甲基化水平與EC患者的病理分期、子宮肌層浸潤深度、淋巴結轉移情況有關，說明血清VIM啟動子甲基化水平可一定程度上反映出EC患者病情的嚴重程度，其具體作用機制可能是因為VIM基因啟動子甲基化而造成VIM及其他相關基因表達降低，進而導致EC患者發生病理學改變，但是具體機制尚不明確，還有待進一步分析。

本研究結果表明，血清SOX1、VIM啟動子甲基化對EC均有一定的診斷價值，而與單獨指標檢測相比，血清SOX1、VIM啟動子甲基化聯合檢測診斷EC的靈敏度、準確度均顯著升高，與相關研究結果一致［15-16］，說明血清SOX1和VIM基因甲基化聯合檢測可用于臨床EC的篩查及早期診斷，由于基因甲基化很容易在惡性腫瘤患者的個體或高危人群中檢測到，因此對SOX1和VIM基因甲基化聯合檢測可進一步判定是否能作為臨床篩查以及診斷的標準。

綜上所述，EC患者血清SOX1、VIM啟動子甲基化水平較對照組女性均顯著升高，與患者病理分期、子宮肌層浸潤深度及淋巴結轉移情況有關，聯合檢測診斷EC的效能最高，說明SOX1和VIM基因甲基化是影響EC發生的潛在標志物，其聯合檢測可用于臨床EC的篩查及早期診斷。然而，EC發生發展的機制復雜，血清SOX1、VIM啟動子甲基化能否用于EC的臨床診斷還需擴大樣本進一步深入的探究。