游離β人絨毛膜促性腺激素定量測定化學發光免疫分析法的建立與性能評價

伍華穎王小艷李志雄董志寧吳英松徐偉文

游離β人絨毛膜促性腺激素（free β human chorionic gonadotrophin，f-β-hCG）是由胎盤合體滋養細胞合成與分泌的一種糖蛋白激素，分子量為22.2 KD，是人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，HCG）的特有結構，決定其分子的生物學和免疫學特性。f-β-hCG在懷孕過程中伴隨HCG一起出現及增長，因此是診斷早孕和孕中期的一項重要的檢測指標［1-4］。血清中f-β-hCG測定不僅能診斷先兆流產、異位妊娠、葡萄胎、唐氏綜合征、子癇前期等疾病［5-7］，也是治療后及預后觀察的重要檢測指標。f-β-hCG檢測還對生殖系統腫瘤如卵巢癌、滋養細胞腫瘤、男性睪丸腫瘤有輔助診斷價值，對一些非生殖系統的腫瘤也有一定輔助診斷意義［8-9］。隨著二胎政策的開放，高齡產婦增加，高危妊娠、異常妊娠概率相應增加，因此能準確測定作為孕期重要檢測指標的f-β-hCG變得尤其重要。本研究旨在研制一種快速的、靈敏度高、準確性好的f-β-hCG定量測定化學發光試劑盒，以期為臨床提供新的可選用的f-β-hCG檢測試劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本

確定參考值范圍的樣本：年齡在21～45歲未懷孕的女性健康查體者血清樣本137例，平均年齡為34.5歲；年齡在19～48歲的9～13周低風險的孕婦血清樣本635份，平均年齡為31.2歲，其中孕9周125例、孕10周129例、孕11周123例、孕12周131例、孕13周127例。

檢測效能比對的樣本：年齡在20～46歲的孕婦血清樣本209例，平均年齡為38.3歲，其中孕9周11例、孕10周14例、孕11周62例、孕12周68例、孕13周54例。

以上血清樣本均來自中國人民解放軍蘭州軍區烏魯木齊總醫院。

1.1.2 試劑

一對配對f-β-hCG單克隆抗體均為美國Meridian公司產品；人源性f-β-hCG蛋白來源于美國Fitzgerald公司；磁微球購自美國的Invitrogen公司；發光物質吖啶鹽來自于蘇州亞科科技股份有限公司；德國羅氏公司的游離β-絨毛膜促性腺激素定量測定試劑盒（電化學發光法）；企業標準品和企業質控品由廣州市達瑞生物技術股份有限公司制備。

質控品：含3個不同濃度水平的血清質控品，批號：201701，購自廣州邦德盛生物科技有限公司。

1.1.3 儀器

廈門優邁科醫學儀器有限公司的全自動化學發光免疫分析儀；德國羅氏公司cobas e601全自動電化學發光免疫分析系統。

1.2 方法

1.2.1 磁微球包被抗體

取0.5 mg f-β-hCG單克隆抗體于超濾離心管中，用0.1 mol/L MES緩沖液重復洗滌8次，收集抗體待用；磁微球用0.1 mol/L MES緩沖液清洗6次后活化20 min，活化后的磁微球再用0.1 mol/L MES緩沖液重復洗滌6次，加入收集好的待用的抗體，放置37℃振蕩反應24 h；用0.1 mol/L MES緩沖液重復洗滌2次，再用含5%BSA的Tris緩沖液37℃振蕩2 h進行封閉未結合位點；用含5%BSA的Tris緩沖液洗滌2次，加入含有蛋白保護劑的緩沖液，放置于2～8℃保存。

1.2.2 抗體標記吖啶鹽

取0.5 mg單克隆抗體于超濾離心管中，用0.1 mol/L PB緩沖液重復洗滌6次后收集抗體，將0.01 mg吖啶鹽加入收集好的單克隆抗體中，放置于恒溫搖床上避光反應16 h，進行分離純化，純化后的標記抗體加入蛋白保護劑，放置于2～8℃保存。

1.2.3 使用濃度的選擇

1.2.3.1 磁微球使用濃度的選擇

將包被有抗體的磁微球稀釋到50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL 3個使用濃度，分別加入25 μL抗原及100 μL標記有吖啶鹽的抗體，恒溫37℃條件下反應30 min后進行清洗，加入預激發液和激發液進行發光值檢測。通過發光值比較得出磁微球的使用濃度為200 μg/mL。

1.2.3.2 吖啶鹽標記物使用濃度的選擇

將標記有抗體的吖啶鹽稀釋到15 ng/mL、30 ng/mL、60 ng/mL 3個使用濃度，分別加入25 μL抗原及50 μL 200 μg/mL磁微球，恒溫37℃條件下反應30 min后進行清洗，加入預激發液和激發液進行發光值檢測。通過發光值比較得出吖啶鹽標記物使用濃度為30 ng/mL。

1.2.4 反應步驟選擇

1.2.4.1 一步法

分別將25 μL樣本、50 μL包被有抗體的磁微球、100 μL標記有吖啶鹽的抗體依次加入反應杯，恒溫37℃條件下反應30 min后進行清洗，加入預激發液和激發液進行發光值檢測。

1.2.4.2 一點五步法

將25 μL樣本、50 μL包被有抗體的磁微球加入反應杯，恒溫37℃條件下反應15 min，再加入100 μL標記有吖啶鹽的抗體，繼續于恒溫37℃條件下反應15 min后進行清洗，加入預激發液和激發液進行發光值檢測。

1.2.4.3 兩步法

將25 μL樣本、50 μL包被有抗體的磁微球加入反應杯，恒溫37℃條件下反應15 min后進行清洗，加入100 μL標記有吖啶鹽的抗體，繼續恒溫37℃條件下反應15 min，再進行清洗，加入預激發液和激發液進行發光值檢測。

1.2.5 反應原理

f-β-hCG化學發光法的反應原理如圖1。

圖1 f-β-hCG的反應原理Figure 1 The reaction of f-β-hCG

1.3 分析性能評價

1.3.1 最低檢測限試驗

用自制的f-β-hCG試劑盒對零濃度校準品進行重復測定20次，計算20次測量結果的平均發光值（mean，M）和標準差（standard deviation，SD），得出M+2SD值，根據零濃度校準品和相鄰濃度校準品的發光值進行兩點回歸擬合得到一次方程，將M+2SD值代入上述方程中，計算得到的濃度即為最低檢出限。

1.3.2 準確性試驗

用樣本稀釋液對游離β-絨毛膜促性腺激素國家標準品進行稀釋，使其最終濃度約為5 ng/mL和100 ng/mL，將其作為樣本重復檢測3次，測得的平均濃度記為M，根據公式：測量偏差=（M-理論值）/理論值×100%。

1.3.3 線性試驗

用高值樣本按5個比例稀釋為5個不同濃度樣本，其中最低濃度樣本的濃度值接近最低檢測限濃度值。對5個濃度樣本分別進行3次重復檢測，計算每個樣本的平均值，再用樣本的平均值和相應的稀釋比例進行四參數擬合，計算線性相關系數r。

1.3.4 重復性試驗

用自制的f-β-hCG試劑盒分別對濃度為20 ng/mL、50 ng/mL、150 ng/mL 3個低、中、高濃度的企業質控品進行重復檢測20次，再分別計算出每個質控品20次檢測結果的平均值（M）和標準差（SD）值，按變異系數（variable cofficient，CV）公式CV=SD/M×100%得出變異系數。

1.3.5 批間精密度試驗

用3個不同批次自制f-β-hCG試劑盒分別檢測3個低、中、高濃度的企業質控品，重復檢測20次，計算60次測量結果的平均值M和標準差SD，計算其變異系數（CV）。

1.3.6 特異性試驗

用自制f-β-hCG試劑盒對促甲狀腺激素（300 mIU/L）、促卵泡激素（200 IU/L）及促黃體生成素（250 IU/L）進行檢測，各檢測3次。

1.3.7 參考值范圍

用自制的f-β-hCG試劑盒檢測經德國羅氏公司β-絨毛膜促性腺激素定量測定試劑盒（電化學發光法）檢測的772份血清樣本，其中635例為9～13孕周的低風險母體血清樣本，137例為未懷孕查體者的血清樣本，根據檢測結果提供自制試劑盒的參考值范圍。

1.3.8 樣本檢測效能比對

以德國羅氏公司的β-絨毛膜促性腺激素定量測定試劑盒（電化學發光法）作為對照試劑，用自制的f-β-hCG試劑盒檢測209例孕婦血清樣本，分析2種試劑盒檢測結果的相關性和一致性。

1.4 統計學處理

用OrigiPro7.5進行四參數擬合建立自制試劑盒線性相關系數r，及對不同反應模式的濃度梯度f-β-hCG劑量-反應擬合Hill曲線，選擇線性關系較好的曲線對應的反應模式。利用SPSS 24.0統計軟件統計分析f-β-hCG在各孕周的濃度分布情況及相關性；用Medcalc軟件進行Bland-Altman分析，對2種試劑盒的一致性作進一步分析。

2 結果

2.1 反應步驟選擇

用包被有抗體的磁微球和標記有抗體的吖啶鹽按照一步法、一點五步法、兩步法反應步驟，以雙抗體夾心法建立f-β-hCG的化學發光免疫分析法，對不同濃度f-β-hCG企業標準品進行檢測。將劑量-反應擬合Hill曲線，結果見表1，根據表1結果可知3種反應步驟中一步法不僅本底比較高且曲線線性相關性比較差，兩步法本底比較低且曲線線性相關性最好，R2為0.997 6。所以我們選擇了曲線線性相關性最佳的兩步法。

表1 濃度與發光值的Hill曲線方程Table 1 Hill curve equation of concentration and luminescence

2.2 分析性能評價

2.2.1 自制f-β-hCG試劑盒定標與質量控制

用校準品對自制f-β-hCG試劑盒進行校準曲線定標，定標成功后，再用第三方廣州邦德盛生物科技公司的血清質控品進行質量控制，定標結果見圖2，質量控制結果見表2。

表2 質控品檢測結果Table 2 Measurement results of control

2.2.2 最低檢測限

根據零濃度校準品和相鄰濃度校準品的濃度-發光值的結果進行兩點回歸擬合，得出一次性方程，得到零濃度校準品的M值為1 051，SD值為32.41，將零濃度校準品的M+2SD值1 115.82代入上述方程中，得到最低檢測限為0.006 ng/mL，不高于0.5 ng/mL。

2.2.3 準確性

對濃度稀釋至5 ng/mL和100 ng/mL的2個f-β-hCG國家標準品樣本進行檢測，濃度為5 ng/mL的國家標準品樣本的檢測結果為（5.13±0.21）ng/mL，相對偏差為4.43%；濃度為100 ng/mL的國家標準品樣本的檢測結果為（98.45±2.33）ng/mL，相對偏差為2.56%。本試劑盒準確性相對偏差均在±10%范圍內。

2.2.4 線性

用濃度為200 ng/mL高值樣本按5個比例稀釋為5個不同濃度樣本，對5個濃度樣本分別進行3次重復檢測，計算每個樣本的平均值，將檢測結果進行四參數擬合，得出線性方程為Y=359 847.365 87+（0.068 94-359 847.365 87）/（1+（X/1 924.888 42）0.99185，線性相關系數R2為1，線性很好（表3、圖3）。

表3 線性檢測結果（n=3）Table 3 Measurement results of linearity（n=3）

2.2.5 重復性

其變異系數（CV）在1.83%～4.35%之間，均小于8%，結果見表4。

2.2.6 批間精密度試驗

用3個批次自制f-β-hCG試劑盒分別檢測濃度為20 ng/mL、50 ng/mL、150 ng/mL 3個低、中、高濃度的企業質控品，其變異系數（CV）分別為2.88%、5.43%、3.67%，均小于15%，結果見表4。

圖2 f-β-hCG定標曲線Figure 2 Calibration curve of f-β-hCG

圖3 f-β-hCG線性擬合Figure 3 Linear fitting of f-β-hCG

表4 重復性和批間精密度的結果Table 4 The results of repeatability and precision between different assays

2.2.7 特異性

將促甲狀腺激素（300 mIU/L）、促卵泡激素（200 IU/L）及促黃體生成素（250 IU/L）作為樣本用自制f-β-hCG試劑盒檢測，結果見表7，本自制試劑盒對促甲狀腺激素檢測結果為（0.32±0.015）ng/mL、促卵泡激素檢測結果為（0.24±0.031）ng/mL、促黃體生成素檢測結果為（0.45±0.024）ng/mL，交叉反應檢測結果均不高于0.5 ng/mL。

2.3 參考值范圍建立

用自制f-β-hCG試劑盒對137份未懷孕查體者的血清樣本進行檢測，檢測結果用SPSS 24.0統計軟件進行統計分析，并對檢測結果按百分數法進行排序，得到未懷孕查體者樣本研究的參考范圍為0～0.5 ng/mL，結果見圖4。

用自制f-β-hCG試劑盒對635份9～13周低風險的孕婦血清樣本進行檢測，分別列出每個孕期的平均值、中位數、第二點五位百分數和第九十七點五位百分數，為自制f-β-hCG試劑盒提供不同孕周f-β-hCG的正常值參考范圍，結果見表5。

圖4 137份未懷孕查體者f-β-hCG測值直方圖Figure 4 Historgram of f-β-hCG in 137 unpregnant women

表5 不同孕周孕婦血清中f-β-hCG的濃度Table 5 Concentrations of f-β-hCG in serum at different weeks of gestation

2.4 樣本檢測效能比對

對年齡在20～46歲的孕9～13周的209份孕婦血清樣本進行檢測，根據各孕周的正常參考值范圍，對照試劑檢測出高值樣本46例，低值樣本33例，正常樣本130例；自制試劑盒檢測出高值樣本46例，低值樣本35例，正常樣本128例，兩者不一致樣本有4例，見表6。從定性結果的一致性上分析，自制試劑盒與對照試劑盒的高值異常符合率為97.8%，低值異常符合率為94.3%，正常符合率為99.2%，總符合率為98.1%。

表6 樣本統計歸納表Table 6 Table of sample statistics summary

表7 樣本一致性的計算結果Table 7 The calculated results of Kappa values for sample

表8 樣本相關性分析結果Table 8 The results of correlation analysis for sample

采用SPSS 24.0統計軟件計算卡方值及其置信區間、相關性r值、線性回歸方程和畫出散點圖。一致性達0.965（P＜0.01，95%置信區間為0.934～0.992）（表7），相關性r值為0.992（P＜0.01，95%置信區間為0.989～0.995）（表8），線性回歸方程為y=1.131x+0.826（P＜0.01，B的95%置信區間為1.111～1.151）（表9），散點圖見圖5，判定系數R2=0.980。采用MedCalc統計軟件作Bland-Altman分析，對自制試劑盒和對照試劑盒的一致性作進一步分析，為了使Bland-Altman分析圖成正態分布，將自制試劑盒與對照試劑盒的測值進行對數轉換，使用其對數值進行Bland-Altman分析，以自制試劑盒測值對數與對照試劑盒測值對數的均值為X軸，以兩者的差值為Y軸，繪制散點圖（圖6），由圖6可見，差值的均數為-0.07，差值95%的分布界限，即95%一致性界限為（-0.01～0.14）ng/mL，經反對數變換，95%一致性界限為（0.98～1.38）ng/mL，偏差在±2.5 ng/mL之間。在95%一致性界限的可信區間之外，僅有6.2%（13/209）的點存在；在95%一致性界限的可信區間之內，其中差值絕對值的最大值為0.02，而其均值為1.90，經反對數變換，差值絕對值的最大值為1.08 ng/mL，其均值為79.4 ng/mL。

表9 樣本線性回歸分析表Table 9 The analysis of linear regression for sample

圖5 相關性分析散點圖Figure 5 The scatter plot of correlation analysis

3 討論

在女性健康方面，f-β-hCG的測定在臨床上有助于診斷和檢測妊娠滋養細胞疾病［10-13］及早期診斷不良妊娠，是識別絨毛膜癌和胎盤部位滋養細胞腫瘤的一個標志物。f-β-hCG也是女性多種非滋養細胞惡性腫瘤中的一個標志物，如宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌。f-β-hCG聯合CA125檢測可提高卵巢癌的診斷率。

然而f-β-hCG并非女性的專屬腫瘤標志物，在男性生殖細胞腫瘤特別是睪丸癌的檢測與跟蹤中，f-β-hCG的檢測也具有很重要的意義。對于胃腸道、肝部的惡性腫瘤的檢出，f-β-hCG的檢測同樣具有意義［14］。

圖6 Bland-Altman分析圖Figure 6 The chart of Bland-Altman analysis

f-β-hCG檢測對預后評價起著重要的作用。在胃腸道腫瘤和卵巢癌中，f-β-hCG是一個獨立的預后因子；f-β-hCG在臨床上亦用于監控肺癌；f-β-hCG蛋白的高表達是乳腺癌不良預后的明顯標志。因此，腫瘤患者在治療之前檢測f-β-hCG可為臨床醫生提供非常重要的治療指導作用［15］。

目前臨床上用于定量檢測f-β-hCG的方法主要有放射免疫分析法、時間分辨熒光法、酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法、化學發光法等。過去以放射免疫分析法為代表的游離β人絨毛膜促性腺激素測定試劑盒，由于受方法學的限制，存在試劑穩定性差、放射性污染等缺點，且操作過程比較復雜，已基本上退出市場，目前應用較廣泛的是酶聯免疫檢測技術和化學發光技術［16-17］。

本研究以雙抗體夾心法建立了一種定量檢測f-β-hCG的化學發光技術新方法，用磁微球以共價交聯的方式包被抗體作為固相載體，不僅實現管式全自動化，還能增強發光信號，提高穩定性［18］。用吖啶鹽作為標記物，以過氧化氫和氫氧化鈉為啟動劑，直接發光反應、簡單、快速、穩定、無放射性同位素損傷和污染。

迄今國內外暫未有用吖啶鹽標記測定f-β-hCG的化學發光方法的相關報道，因此，本研究在質控品檢測結果均符合要求、實驗結果準確可靠的情況下，對自制f-β-hCG試劑盒進行各項性能評價，自制試劑盒的最低檢測限能達到0.006 ng/mL，而國內外市場使用率較高的羅氏進口f-β-hCG試劑盒最低檢測限為0.01 ng/mL，自制試劑盒靈敏度更優；通過樣本效能比對試驗，自制試劑盒與羅氏進口試劑盒的相關性達到0.992、一致性達到0.965，總符合率為98.1%，說明自制試劑盒與進口試劑盒具有較好的一致性，同時也說明了自制試劑盒質量甚至更優于進口試劑盒。自制試劑盒的準確度的相對偏差最高為4.43%，其具有良好的重復性和精密性，批內重復性CV值小于8%，批間精密度試驗CV值小于15%，線性范圍在0～200 ng/mL之間，相關性很好，特異性比較高。

自制試劑盒與羅氏進口試劑盒進行樣本檢測效能比對，自制試劑盒的一致性達到0.965，相關性r值達到0.992，說明自制試劑盒與應用較廣的進口試劑盒具有較好的一致性及等效性。

根據郭翀等人［19］和鄒麗萍［20］分別用時間分辨熒光法及光激化學發光法評價f-β-hCG的結果，時間分辨熒光法及光激化學發光法的靈敏度分別為0.09 ng/mL和0.11 ng/mL、重復性均CV值小于10%，而自制試劑盒的靈敏度能達到0.006 ng/mL、重復性CV值小于8%。因此，本研究用化學發光法研究的自制試劑盒各項性能均優于用時間分辨熒光法及光激化學發光法研制的試劑盒。綜上所述，用化學發光法建立的游離β人絨毛膜促性腺激素定量測定試劑盒靈敏度高、準確性高、重復性好、線性范圍寬、特異性高，有望能替代昂貴的進口試劑應用于臨床檢測及研究。