CRISPR穩步走向臨床

編譯 凌寒

基因編輯技術已經在一些罕見的情況下進行試驗，更多的人體臨床試驗即將啟動。

自從CRISPR-Cas9基因編輯技術問世以來，它就激發了人們對其或夸張或謹慎的預測：例如，我們也許很快就能讓遠古時代的野獸復活，或者創造出經過設計的嬰兒。雖然此類應用可能永遠都沒有機會問世，但基因編輯技術已經在遺傳學研究領域掀起了一場革命，它使得科學家能夠在實驗室中輕松操縱模式生物。此外，許多生物醫學科學家將該系統視作修復活躍在無數遺傳疾病中的問題DNA的一種方法。

奮戰在基于CRISPR技術的治療方法研發前沿的科學家和企業已經從相對溫和的目標入手，瞄準了罕見的單基因疾病，主要目標是移植經過修飾的細胞，而不是在體內設置一個基因編輯遞送系統。但如果監管機構能夠批準，這類療法可以作為CRISPR在醫學上更廣泛使用的“風向標”。

克利夫蘭診所的醫學遺傳學家戴維·弗蘭納里（David Flannery）表示：“到目前為止，基因療法一直包括試圖將基因（新拷貝）植入人體細胞中，而這一直很困難。”相反，CRISPR提供了一種對細胞中已經存在的基因進行微調的方法。

CRISPR體外療法

2017年，隨著諾華公司Kymriah療法獲批，美國食品藥品管理局（FDA）首次批準了一種包含轉基因細胞的治療方法——這是一種癌癥免疫療法。將患者自身的T細胞從血液中提取出來，然后用一種插入了嵌合抗原受體（CAR）基因的病毒進行處理。生成的CAR-T細胞隨后被擴增并重新輸回體內。目前正在開發中的基于CRISPR技術的體外療法也采用了類似的方法。

賓夕法尼亞大學腫瘤學家愛德華·斯塔德特摩爾（Edward Stadtmauer）啟動了一期臨床試驗來測試一種療法，該療法將符合條件的癌癥患者血液中的T細胞過濾出來，然后使用CRISPR技術敲除細胞現有的3個T細胞受體（TCRα,TCRβ,PD-1）并且以慢病毒為載體向細胞中插入NY-ESO-1（一種出現于某些癌癥細胞表面的蛋白）的受體。經過修飾的細胞被擴增過幾周，且患者接受了簡短的化療后，研究人員會將這些細胞回輸至患者體內，斯塔德特摩爾說道。他目前正在為此次臨床試驗招募患者。

總部位于瑞士的CRISPR療法公司也正在籌備基于CRISPR的癌癥免疫療法。該公司已宣布，計劃在2018年年底前向FDA提交一份該類療法相關的臨床試驗性新藥（IND）申請。在賓夕法尼亞大學進行的試驗中，該療法是基于敲除T細胞受體，并添加一種CAR用于尋找癌癥相關表面蛋白——在本案例中，該蛋白為CD19。與賓夕法尼亞大學采用的方法不同的是，該公司計劃使用來自健康捐贈者的細胞，并移除其主要組織相容性復合體1。該公司研究人員希望，這種修飾能夠使該療法在不觸發免疫反應的情況下，應用于多名患者。

用于自體CAR-T療法的患者細胞被多次暴露于抗原和炎癥信號中。其結果就是，他們“經常被折騰得體無完膚，筋疲力盡，當遇到抗原時，他們往往無法擴增，”該公司研發部門主管托尼·霍（Tony Ho）解釋道，“使用我們的技術，可以打造出……一種通用的現成的治療方法。”該療法使用了健康人的細胞來避免這種缺陷。

除了癌癥，CRISPR療法公司旨在利用體外CRISPR編輯治療β-地中海貧血和鐮狀細胞性貧血等血液疾病。他們的想法是從患者的血液中提取造血干細胞，并對其進行編輯，使其能夠生成胎兒血紅蛋白，以此作為變通方案來解決這兩種疾病中存在的有缺陷的成人血紅蛋白的問題。公司已向歐洲監管機構申請許可，以便為β-地中海貧血啟動1/2期臨床試驗，并計劃2018年晚些時候對其首個患者進行治療，但其準備在美國進行的針對鐮狀細胞性貧血的類似治療計劃5月份時卻被擱置，因為FDA在對IND進行審查時要求該公司回答附加問題。

斯坦福大學的醫學研究員馬修·波提烏斯（Matthew Porteus）和他的團隊一直致力于修復造血干細胞中的主效突變位點，這是治療鐮狀細胞性貧血的一種更為直接的方法。因為這種疾病是由單核苷酸突變引起的，“紙上談兵說起來就很輕松，‘如果我們能把它恢復到不會引起疾病的狀態，我們就能夠治愈這種疾病了。’”他說道。

在實驗室中，研究小組利用了CRISPR和同源介導的修復（HDR）技術，該技術在修復CRISPR的雙鏈斷裂時，為細胞提供一些DNA作為模板。此技術用以修復患者60%到80%的突變細胞，波提烏斯預計這一比例用于緩解疾病癥狀的治療將綽綽有余。下一步則是將這些經過編輯的細胞回輸到患者體內，讓他們自然地進入骨髓，并開始產生健康的紅細胞。波提烏斯估計關于這種療法的臨床試驗可能會在2019年年中啟動。最終，他希望不僅能夠治療鐮狀細胞性貧血，也能治愈其他血液遺傳疾病，包括β-地中海貧血。“如果我們成功了，我相信我們將擁有可以應用于數百種其他疾病的平臺，甚至不需要太多改變。”他說道。

加州大學伯克利分校的基因組編輯研究員雅各布·科恩（Jacob Corn）也在使用HDR技術治療鐮狀細胞疾病，同時也著眼于圍繞造血干細胞的其他相關疾病。他將他的團隊的方法比喻成對病人的基因組進行精確的“手術”，該“手術”根據每個人的突變進行定制編輯。科恩是一家基因編輯生物技術公司“聚焦療法”的聯合創始人，同時也從其他幾家公司獲得酬金或擁有股份。他希望最早能在2019年啟動關于鐮狀細胞病的臨床試驗。

“每天都能得到很多振奮人心的結果。”科恩說，“盡管目前還沒有類似治療方法進入市場，但我樂觀地認為，就算花上10年時間，我們也要看到廣泛應用的治療性基因編輯。”

CRISPR原位療法

位于馬薩諸塞州坎布里奇市的Intellia療法公司針對癌癥和鐮狀細胞疾病的體外療法已進入臨床前準備階段，但實際上其最先進的項目是體內療法。利用脂質納米顆粒將CRISPR機制遞送給甲狀腺素運載蛋白淀粉樣變性患者的肝細胞，研究人員希望此舉能夠使發生了突變的編碼甲狀腺素運載蛋白的等位基因失效。這種蛋白質在人體中并沒什么重要作用，但它的一種異常版本卻可以在外周循環系統中形成沉淀，導致四肢感覺喪失；有時則在自主神經系統中形成沉淀，這種情況則會引發生理功能障礙。Intellia公司高級副總裁湯姆·巴恩斯（Tom Barnes）說：“通常情況下，甲狀腺素運載蛋白在人體中沒什么重要作用，所以與其讓你患上這種致命的淀粉樣變性，那么還不如完全清除這種蛋白質。”這種治療方法旨在同時敲除這兩種拷貝，一次性治療在小鼠身上顯示出了持續的療效，公司計劃在2019年晚些時候提交IND申請。

向體內注射CRISPR的潛在陷阱是存在引發免疫反應的風險。位于馬薩諸塞州坎布里奇市的愛迪塔斯醫藥公司成立于5年前，其合伙人包括博德研究所的張鋒和哈佛大學的喬治·丘奇（George Church），研究者們希望在治療遺傳性眼疾時，將CRISPR直接遞送至眼部和其他擁有免疫豁免特性且不太可能因治療產生炎癥反應的器官來避免這樣的問題。

籌備中的最成熟的療法，其治療對象是萊伯氏先天性黑蒙中的一種，這種遺傳性疾病會導致視力喪失或失明。在愛迪塔斯公司瞄準的這種疾病亞型中，內含子的一個點突變會導致CEP290轉錄本的拼接異常。該療法旨在通過非同源性末端接合（NHEJ）——一種不涉及模板的DNA修復過程——來剪除突變。2018年5月，在美國基因與細胞治療學會會議上，一位來自愛迪塔斯公司的研究員展示了該療法在獼猴中的實驗結果，結果顯示該療法耐受性良好，并成功編輯了CEP290基因。該公司宣布計劃很快提交IND申請。“我們相信，如果我們修復了CEP290蛋白，我們也將恢復‘眼部光感受器的功能’，從而顯著改善這些視力嚴重受損（如果不是失明的話）的患者的視力。”首席科學家查理·奧爾布賴特（Charlie Albright）解釋說。

愛迪塔斯公司還將從萊伯氏先天性黑蒙治療方案的研發過程中吸取的經驗應用到其他遺傳性眼科疾病的治療中，比如亞瑟綜合征2a，以及致盲性單純皰疹病毒I型感染，奧爾布賴特說道。

CRISPR療法面臨重重考驗

無論體內療法還是體外療法在進入臨床的道路上都面臨著重重考驗。在體內進行基因編輯時，遞送是一個棘手的挑戰。巴恩斯告訴《科學家》雜志：“CRISPR的偉大之處在于,當它位于細胞核內時，它的工作原理就像宣傳的那樣。”“挑戰在于你需要圍繞它構建相關平臺。”巴恩斯說，用患者自身經過改造的細胞制成的治療藥物非常復雜，生產工藝復雜，相比其他藥物，其注冊審批流程不甚明確。

除了這些挑戰之外，新的研究不斷發現CRISPR體內和體外療法潛在的有害副作用。例如，2018年6月，兩篇論文發現：在某些類型的細胞中，CRISPR有可能通過p53通路導致細胞死亡，因此，在編輯過程中存活下來的細胞很可能攜帶p53突變——一種可能會致癌的缺陷。7月，研究人員報告說，由CRISPR誘發的剪切可能會在基因組的遠端產生意想不到的影響。關于這兩個案例的新聞均導致了致力于開發CRISPR療法的公司股價下跌。

致力于開發CRISPR療法的研究人員告訴《科學家》雜志，他們早就意識到了這種危險，同時正在采取措施減輕這種危險。然而，考慮到Cas9能夠導致雙鏈DNA斷裂，“總有出問題的可能性，”6月份其中一篇研究論文的共同作者、劍橋大學的尤西·泰帕雷（Jussi Taipale）說，“因此，在醫療效益和治療風險之間取得平衡至關重要。”

CRISPR療法

研究人員希望利用CRISPR-Cas9基因編輯技術開發出多種遺傳疾病甚至癌癥的治療方法。這些臨床干預可能采取體外治療的形式，即在實驗室中對細胞進行編輯并將其輸入患者體內；或者體內治療的形式，即將基因編輯裝置直接遞送到受疾病影響的組織。

方法：從血液中提取細胞，使用CRISPR對其進行修飾，編輯后的細胞進行擴增，并將其注入體內；另一種方法是將來自健康供體的經過修飾的細胞進行擴增，并注入多個患者體內例子：幾個研究小組和公司正在開發通過修飾自體造血干細胞治療鐮狀細胞病或β-地中海貧血的治療方法，已在2018年開始試驗正在進行的試驗旨在通過定制受體來修飾自體或供體T細胞，以期更好地對抗癌癥 障礙：監管機構對定制的、基于細胞的療法缺乏經驗，而且其制造工藝比傳統藥物的生產工藝要復雜得多 體外療法 體內療法方法：使用載體，比如納米顆粒或病毒，將CRISPR-Cas9遞送至體內的靶細胞或組織例子：愛迪塔斯公司正計劃為一項試驗提交IND申請，該試驗會將攜帶CRISPR-Cas9的腺相關病毒注射到眼部，作為萊伯氏先天性黑蒙的治療方案Intellia療法公司計劃2019年提交一份IND申請，用于治療甲狀腺素運載蛋白淀粉樣病變，該療法使用攜帶CRISPR的脂質納米顆粒來清除肝臟中產生的一種致病的異常蛋白障礙：將CRISPR-Cas9植入能夠起到治療作用的足夠數量的靶細胞是一項重大挑戰。潛在的安全問題包括對基因組進行非目標性編輯的可能性，以及在接受者體內引發免疫反應的可能性

資料來源 The Scientist