TP53基因在維吾爾族食管癌中的基因表型、蛋白表達及其與預后的相關性

阿不都沙拉木·阿不都熱合曼 買地尼也提·尼亞孜 張海平 居來提·艾尼瓦爾 阿不都艾尼·吐爾洪 張力為 伊力亞爾·夏合丁 伊地力斯·阿吾提

[摘要] 目的 探討維吾爾族食管癌組織中TP53基因缺失和p53蛋白表達狀況及其與預后的相關性。 方法 選取2009年12月～2013年6月在新疆醫科大學第一附屬醫院胸外科行根治性手術切除的維吾爾族食管鱗狀細胞癌患者67例，應用熒光原位雜交技術檢測其間期細胞核中TP53基因缺失情況，并通過免疫組化方法檢測p53蛋白表達情況，分析TP53基因表型、蛋白表達與臨床病理因素及術后生存期的關系。 結果 在食管癌高分化組中TP53基因的缺失率為15.00%，而在中、低分化組中為40.43%，差異有統計學意義（P < 0.05）；而TP53基因缺失在不同腫瘤浸潤深度、不同淋巴結轉移狀態樣本中的差異無統計學意義（P > 0.05）。p53蛋白表達在不同腫瘤分化程度、不同腫瘤浸潤深度和不同淋巴結轉移狀態樣本中的差異均無統計學意義（P > 0.05）。 結論 TP53基因缺失與食管癌腫瘤分化程度有一定的相關性，但與術后生存期關系不能確定，TP53基因缺失和p53蛋白表達尚不能作為評估維吾爾族食管癌患者預后的生物標志物，需要增加樣本量進一步確定。

[關鍵詞] 維吾爾族；食管鱗狀細胞癌；p53；預后

[中圖分類號] R739.45 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）06（b）-0017-04

[Abstract] Objective To study the TP53 gene deletion and p53 protein expression level in Uygur′s esophageal carcinoma， and its correlation with prognosis of Uygur esophageal cancer patients. Methods Sixty-seven cases of Uygur esophageal squamous cell carcinoma treated by radical resection from December 2009 to June 2013 in Department of Thoracic Surgery， the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University were selected. TP53 gene deletion and p53 protein expression was detected respectively by fluorescence in situ hybridization and immuno-histo-chemistry methods. The relationship of TP53 gene deletion and p53 protein expression with clinicopathological factors and postoperative survival rate was analyzed. Results In the highly differentiated group， the deletion rate of TP53 gene was 15.00%， which of moderate and poorly differentiation group was 40.43%， the difference was statistically significant （P < 0.05）. There was no significant difference of the deletion rate of TP53 gene in different tumor invasion depth and lymph node metastasis status （P > 0.05）. There was no significant difference of the degree of p53 protein expression in different degrees of tumor differentiation， tumor invasion depth and lymph node metastatis status （P > 0.05）. Conclusion There is a certain correlation between TP53 gene deletion and the differentiation degree of esophageal carcinoma tumor， but the relationship with the survival has not been determined. The TP53 gene deletion and p53 protein expression level cannot be seen as the prognostic biomarkers of Uygur patients with esophageal cancer. Therefore， larger sample capacity is needed for in-depth exploration and determination.

[Key words] Uygur； Squamous cell carcinoma of the esophagus； p53； Prognosis

食管癌是世界常見的惡性腫瘤之一，中國是食管癌高發地，以鱗癌為主[1]。食管癌發病率和病因學因素存在著明顯的地域性差異和種族差異[2]，新疆是多民族聚集區，也是食管癌高發地區，維吾爾族是食管癌高發民族之一[3]。食管癌發生發展與多基因、多因素有關，TP53基因是一種參與細胞周期調控的抑癌基因，其編碼的野生型p53蛋白控制細胞周期的啟動，防止突變基因出現遺傳不穩定性和癌變[4]，與人類多數惡性腫瘤有關[5]。雖然p53蛋白過度表達經常被認為是一個對TP53基因突變的替代，但它與基因序列檢測結果具有較高的假陽性和假陰性[6]。FISH技術檢測出染色體突變和特定基因拷貝數改變而診斷惡性細胞的方法[7]，國內外研究已證實TP53基因缺失與食管癌的發生、發展有關[8-9]。但其在維吾爾族食管癌患者中的表型和表達鮮見報道。

本研究應用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技術和免疫組化技術檢測維吾爾族食管癌組織中TP53基因缺失和p53蛋白表達情況，并分析其在不同分化程度、不同腫瘤浸潤深度及不同淋巴結轉移狀態樣本中的差異，評估TP53基因在維吾爾族食管癌發生、發展中的作用及其與食管癌預后的相關性。

1 材料與方法

1.1 標本收集

收集2009年12月～2013年6月在新疆醫科大學第一附屬醫院行食管癌根治術的維吾爾族食管鱗狀細胞癌患者67例，其中男50例，女17例；根據世界衛生組織（WHO）第7版標準[10]進行病理學診斷，包括腫瘤分化、腫瘤浸潤、腫瘤分期：67例患者中高分化20例，中度分化43例，低分化4例；T1和T2共19例，T3和T4共48例；區域淋巴結轉移陽性36例，陰性31例；術后TNM分期Ⅰ期8例，Ⅱ期30例，Ⅲ期29例。

術后組織離體后取新鮮腫瘤組織和癌旁正常組織（距癌組織5 cm以外處）標本，新鮮腫瘤組織在載玻片上觸貼式制作FISH檢測標本，浸入10%中性甲醛，按照標準程序石蠟包埋。連續切片（4 μm）進行蘇木精染色、免疫組化檢測。本研究經醫院倫理委員會批準，并獲得患者的書面知情同意。

1.2 FISH方法

應用FISH方法檢測TP53基因缺失突變情況，使用雙色FISH探針即橙色熒光標記的LSI TP53探針和綠色熒光標記的17號染色體著絲粒探針（Cytocell Ltd，英國）。組織芯片在60℃烤片2 h后，將用二甲苯脫蠟和梯度乙醇溶液水化，空氣干燥組織切片。在80℃ Vysis pretreatment solution中孵育15 min。用超純水液洗滌后用Vysis protease Ⅰ溶液，在37℃中孵育10 min，并用超純水洗滌，在冷乙醇溶液脫水（70%、80%、90%、100%各2 min）。滴加10 μL的雜交混合物后蓋上蓋玻片，用橡膠泥密封。用雜交儀變性雜交（變性條件：75℃，5 min；雜交條件：37℃，過夜）。次日，用（73±1）℃的2×SSC溶液洗滌2 min，再放入同樣緩沖液在室溫下洗滌1 min。

FISH評分：計數100個有熒光信號的不重疊細胞核，根據信號改變的細胞核百分比來計算。FISH陽性判別標準：正常細胞有兩個紅色和綠色信號，p53的紅色信號為一個或零信號，并且缺失率在30%以上判定為缺失。

1.3 免疫組化染色方法

應用免疫組化方法檢測p53蛋白表達情況，使用免疫組化Envision法對所有切片行p53染色標記，小鼠抗人p53單克隆抗體購自Sigma公司（美國）。免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。實驗嚴格按說明書進行，一抗濃度1∶100，用0.01 mol/L PBS替代一抗作為陰性對照，用已知乳腺癌陽性組織切片為陽性對照。由2位病理科醫師采取雙盲法觀察切片并診斷，結果一致則記錄結果，如有爭議，以2個相同意見為準。p53蛋白陽性標準：原發灶≥10%的癌細胞有明顯的核棕黃色或棕褐色染色，包括一些黏膜的基底細胞層中≥10%的細胞有相應的p53特征染色為陽性。只限于基底細胞的很弱的染色被認為陰性[11]。根據陽性標本數量與總數的比例計算陽性率。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件包進行數據分析，計數資料比較采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TP53基因缺失和p53蛋白表達情況

p53蛋白的陽性細胞染色定位于細胞核，在67例食管鱗癌組織標本中的陽性表達率明顯高于癌旁正常食管組織，差異有統計學意義（P < 0.05）。67例患者癌組織中TP53基因缺失率明顯高于癌旁正常食管組織，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表1。

67例食管鱗癌組織標本中，TP53基因缺失22例，其中18例p53蛋白陽性；TP53基因檢測未缺失的45例樣本中p53蛋白陰性31例，兩種結果符合率為73.13%（49/67）。

鏡下可見癌組織p53蛋白表達陽性與癌旁組織表達陰性，癌組織TP53基因缺失陽性與癌旁組織陰性，見圖1（封四）。

2.2 TP53基因缺失和p53蛋白表達與臨床病理因素的相關性

統計學結果顯示，p53蛋白在不同腫瘤分化程度、腫瘤浸潤深度、病理分期和淋巴結轉移人群之間的表達，差異無統計學意義（P > 0.05）。TP53基因缺失在不同腫瘤浸潤深度、病理分期和淋巴結轉移人群之間的差異無統計學意義（P > 0.05）。TP53基因缺失情況在高分化組與中低分化組之間比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表1。

3討論

食管癌是消化道常見腫瘤，手術切除目前仍是其最主要的治療手段。由于大多患者診斷明確時已到中晚期，加之術后復發、轉移等因素使食管癌預后不良[12]。因此，早期診斷、早期治療是改善預后的關鍵因素。食管癌的發生是多步驟、多階段基因異常累計結果，原癌基因激活、抑癌基因失活是腫瘤發生發展過程中重要的分子遺傳學基礎，TP53是目前發現的最重要的抑癌基因之一[13]，TP53基因缺失和突變情況常發生在食管癌早期階段[14-15]，TP53基因缺失在食管癌的早期診斷中有一定應用價值[16]。

維吾爾族食管癌患者大多數是癌癥中晚期才診斷明確的，其主要原因是患者出現癥狀時未及時到醫院檢查，其中一半患者在了解胃鏡檢查取病理的重要性以及可以行無痛胃鏡檢查的前提下，還是會拒絕行胃鏡檢查，而不能取病理明確診斷，還有部分患者胃鏡取活檢部位不準確而再次行胃鏡檢查時被患者拒絕，故本研究希望明確食管癌的早期診斷指標。

本研究中食管癌組織中TP53基因缺失率和p53蛋白表達均明顯高于癌旁正常食管組織，結果分析差異有統計學意義，說明TP53基因缺失和p53蛋白表達與食管癌的發生有密切關系。p53蛋白陽性表達率為47.76%，TP53基因缺失率為32.84%，TP53基因缺失的比率小于蛋白表達率。這可能是因為基因多種突變方式都可引起p53蛋白表達異常，p53蛋白功能可以通過突變以外其他機制失活，此結果與國外發表的相關研究報道一致[17]。

p53蛋白陽性表達與維吾爾族食管癌患者腫瘤分化程度、腫瘤分期與病理分期等臨床病理因素無相關性（P > 0.05），國內外有相同的研究結果[17-19]，也有不同的結果[20-22]，這可能與人群基因特點、樣本量少、隨機抽樣誤差等有關。

TP53基因缺失情況與腫瘤分化程度有關，高分化組中TP53基因缺失率為15.00%，在中、低分化組中為40.43%，分化程度低者，TP53基因缺失陽性率高（P < 0.05）。分化程度是影響食管癌預后的因素之一，TP53基因缺失情況與分化程度的關系提示其可能影響患者預后，需要擴大樣本量進一步進行分析。

綜上，本研究結果顯示TP53基因缺失與食管癌腫瘤分化程度有一定的相關性，但與術后生存期關系不能確定，TP53基因缺失和p53蛋白表達尚不能作為評估維吾爾族食管癌患者預后的生物標志物，TP53基因缺失和p53蛋白表達在維吾爾族食管癌發生發展中的作用需要進一步研究。

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