微小RNA miR-148b-3p在人膠質瘤細胞中的表達及意義

李妍哲,李朝暉,王 冠,韋 博

(吉林大學中日聯誼醫院 神經外二科，吉林 長春130033)

微小RNA(miR)是一種在轉錄后水平調控基因表達的非編碼RNA， 其與腫瘤的發生發展密切相關[1,2]。miR-148b-3p是miR-148家族的一員，在乳腺癌、肺癌、肝癌等多種腫瘤的發生發展中發揮重要的作用[3,4]。迄今為止， miR-148b-3p在膠質瘤中的表達及生物學意義尚無報道。本研究檢測miR-148b-3p在膠質瘤細胞中的表達水平，并探討其在膠質瘤細胞增殖和侵襲中的生物學意義。

1 材料與方法

1.1材料

DMEM培養基購于南京凱基生物科技發展有限公司，Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，DMSO和MTT購自杭州昊天生物公司， HiFi-鼠白血病病毒反轉錄酶(MMLV)cDNA第1鏈合成試劑盒、Ultra SYBR熒光定量PCR試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司。Lipofectamine2000和細胞周期DNA含量檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司。Matrigel基底膜購于BD公司， Transwell小室購自Millipore公司。

1.2細胞培養

人膠質瘤細胞A172和人星形膠質細胞HA1800均購自中科院上海細胞所。A172細胞和HA1800細胞培養于含青霉素100 IU/mL、鏈霉素100 μg/mL、10%滅活胎牛血清的DMEM培養基中，在37℃、飽和濕度及5%CO2的培養箱中培養，0.25%胰酶消化傳代。實驗時取對數生長期的細胞。

1.3熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)

Trizol試劑提取總RNA，采用莖環引物法，利用HiFi- MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA，miR-148b-3p莖環引物序列： 5′GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACC-AGAGCCAACACAAAG3′。逆轉錄產物用SYBR試劑盒進行熒光定量PCR反應，U6作為內參。miR-148b-3p引物，上游：5′-CGGTCAGTGCATCACAGAA-3′，下游：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。U6引物，上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。qRT-PCR反應條件為95℃，10 min；94℃，30 s， 58℃，30 s，72℃，60 s，40個循環；72℃，10 min。qRT-PCR結果利用2-△△Ct法進行計算分析。

1.4miR-148b-3pmimics合成及細胞轉染

miR-148b-3p mimics、miR-148b-3p mimics陰性對照(NC)由百奧邁科生物技術有限公司合成。miR-148b-3p mimics序列為5′-CGGGGAGAGAACGCAGUGACGU-3′，miR-148b-3p mimics NC序列為5′- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′。利用Lipofectamine2000轉染試劑轉染至膠質瘤A172細胞。實驗分為三組：空白對照(Blank)組、NC組和miR-148b-3p mimics組。

1.5MTT法檢測細胞增殖

取對數生長期的A172細胞，以2×104/mL的密度接種于96孔培養板上，每孔100 μL。細胞增長至 50%-60%時，轉染miR-148b-3p mimics或 NC。于細胞培養箱中繼續培養24、48、72 h后，利用MTT法測定細胞的生長活性，生長活性以570 nm波長吸光度OD值表示。計算細胞增殖率，細胞增殖率=實驗組OD值/對照組OD值。

1.6Transwell實驗檢測細胞的侵襲能力

無血清培養基8∶1稀釋Matrigel膠，均勻鋪于Transwell小室，每孔50 μL，37℃反應30 min。各組細胞以5×104個/孔接種于Transwell小室，在含5%CO2的培養箱中37℃連續培養24 h。用濕棉棒擦去上室底部膜表面上的細胞，揭下底部膜，底部向上晾干后移至載玻片上，用中性樹膠封片。顯微鏡下隨機取9個視野計數，統計結果。

1.7Guava微流式細胞分析儀檢測細胞周期

收集A172細胞，用PBS洗滌1次，加入700 mL/L乙醇1 mL固定過夜，第2 天離心除去乙醇，用含2 g/L PI的PBS 500 μL重懸，避光孵育30 min，過200目細胞篩，利用Guava easy Cyte 8微流式細胞分析儀檢測細胞周期。

1.8統計學方法

2 結果

2.1miR-148b-3p在膠質瘤細胞A172及正常星形膠質細胞HA1800中的表達

qRT-PCR檢測A172和HA1800中miR-148b-3p的相對表達量。結果顯示，miR-148b-3p在A172和HA1800中的表達量分別為0.27±0.06和1.16±0.21，膠質瘤細胞A172 中miR-148b-3p的表達水平較正常星形膠質細胞HA1800顯著降低(P<0.01，圖1)。

2.2miR-148b-3pmimics轉染對膠質瘤細胞A172增殖的影響

為進一步檢測miR-148b-3p mimics對膠質瘤細胞A172增殖的影響，我們利用MTT法比較轉染后各組細胞增殖率的變化。MTT結果顯示，NC組與Blank組相比，轉染24 h、48 h及72 h后細胞增殖率均無明顯差異(P>0.05)。miR-148b-3p mimics組與NC組相比，在轉染24 h后細胞增殖率下降(12.33±0.46)% (P<0.05)，在轉染48 h和72 h后細胞增殖率分別下降(18.35±0.64)% 和(30.54±1.22)%(P<0.01)，結果有統計學差異(圖2)。

2.3Transwell實驗檢測miR-148b-3pmimics對膠質瘤細胞A172侵襲能力的影響

miR-148b-3p mimics轉染A172細胞48 h后，收集細胞，轉移至Transwell小室繼續培養24 h，固定細胞，姬姆薩染液染色，觀察膠質瘤細胞A172的侵襲能力。如圖3所示，miR-148b-3p mimics組穿過小室基底膜的紫色細胞數較Blank組及NC組明顯減少。顯微鏡下隨機取9個視野計數，統計顯示，Blank組、NC組及miR-148b-3p mimics組的穿膜細胞數分別為86.4±2.1、87.1±4.6和23.1±1.8，miR-148b-3p mimic組與Blank組及NC組相比較，具有顯著統計學差異(P<0.01)，miR-148b-3p mimics組A172細胞侵襲能力顯著低于Blank組及NC組。結果表明，miR-148b-3p mimic能夠抑制膠質瘤細胞的侵襲能力。

圖1膠質瘤細胞A172及正常星形膠質細胞HA1800中miR-148b-3p的表達量；miR：微小RNA

圖2 miR-148b-3p mimics轉染對膠質瘤細胞A172增殖的影響

圖3 miR-148b-3p mimic轉染對膠質瘤細胞A172侵襲能力的影響

2.4流式細胞術檢測miR-148b-3pmimics對膠質瘤細胞A172細胞周期的影響

miR-148b-3p mimics轉染A172細胞24 h、48 h及72 h后，收集細胞，PI染色，Guava微流式細胞分析儀分析各組細胞周期。結果顯示，隨著時間的延長，轉染miR-148b-3p mimics后的膠質瘤細胞A172 G0/G1期細胞逐漸增加，S期相對減少。結果表明，在膠質瘤細胞A172中miR-148b-3p mimics顯著增加細胞周期的阻滯。

3 討論

膠質瘤是最常見的中樞神經系統原發性惡性腫瘤，其發生發展涉及非常復雜的分子機制[5]。miRNA 是一類非編碼RNA，通過識別并結合靶mRNA 3′末端的種子序列，促進靶mRNA降解或抑制其翻譯。已有研究發現多種miRNA 在膠質瘤的生長、侵襲及血管生成等過程中發揮重要的調控作用。吳淳等[6]研究發現miR-140-5p可抑制膠質瘤細胞株U87和U251的增殖，阻滯細胞周期，并顯著抑制其侵襲能力。邵靈敏等[7]報道下調miR-19a可上調膠質瘤細胞U87中多亮氨酸重復區免疫球蛋白樣蛋白1(LRIG1)的表達，進一步抑制U87細胞的侵襲能力。

圖4 miR-148b-3p mimics轉染對膠質瘤細胞A172細胞周期的影響

miR-148家族由miR-148a、miR-148b、miR-152三位成員構成，其中前體miR-148b包括兩個發揮功能的成熟miRNA，miR-148b-3p和miR-148b-5p。miR-148b-3p在多種腫瘤的發生發展中發揮重要的作用。有研究報道，miR-148b-3p可靶向調控WNT1/β-catenin信號通路，從而抑制肝癌細胞的增殖和侵襲[8]。另有研究發現，miR-148b-3p可負向調控DNA甲基轉移酶抑制乳腺癌的增殖和侵襲[9]。對于miR-148b-3p在膠質瘤中的表達情況及作用，至今尚未見報道。

在本研究中，我們檢測miR-148b-3p在膠質瘤細胞中的表達水平，并對miR-148b-3p在膠質瘤細胞增殖和侵襲中的作用進行初步探討。首先利用qRT-PCR方法檢測到miR-148b-3p在膠質瘤細胞中的表達水平較正常星形膠質細胞中明顯下降。為進一步明確miR-148b-3p在膠質瘤增殖和侵襲中的作用，我們合成miR-148b-3p mimics，利用脂質體瞬時轉染法轉染至A172細胞，觀察miR-148b-3p過表達后對膠質瘤細胞增殖和侵襲的影響。MTT結果顯示，miR-148b-3p過表達的A172膠質瘤細胞生長明顯受到抑制；細胞周期實驗發現miR-148b-3p過表達可以阻滯膠質瘤細胞G0/G1期向S期轉換；同時，Transwell實驗結果發現miR-148b-3p過表達可以明顯抑制A172細胞的侵襲能力。

本研究結果表明，miR-148b-3p在膠質瘤中呈低表達，在膠質瘤中發揮抑制腫瘤細胞增殖和侵襲的作用。