P16、RB在甲狀腺良惡性結節中的表達差異性研究

胥 柯，蔣浩海，王春雷，劉艷梅

(鹽城市第一人民醫院 內分泌科，江蘇 鹽城224000)

甲狀腺結節(TN)一般是經觸診或超聲檢查時發現[1]。由于TN發病率較高，起病隱匿，且病程緩慢，漏診誤診率一直較高。雖然大多TN患者為良性結節，但是仍有5%-10%的患者為惡性癌變[2]。而且近幾年甲狀腺微小癌的發病率逐年升高，更增加了惡性TN的診斷難度[3]。超聲檢查一直是篩選甲狀腺癌的首選手段[4]，本項研究旨在通過探討甲狀腺結節患者超聲表現與P16、RB等標志性分子的關系，對甲狀腺良、惡性結節進行區分，并對預后進行評估，為選擇合理的治療方案提供理論支持。

1 資料與方法

1.1主要儀器和試劑

BLS-X6彩色多普勒超聲診斷儀(購自徐州貝爾斯電子科技有限公司有限公司)；BX12A-VS金相圖像分析系統(購自上海中恒儀器有限公司公司)；金圖文醫學影像處理分析系統(購自武漢超聲醫學科技發展中心)；凝膠成像儀(購自復日科技有限公司)；UV-8000紫外分光光度計(購自上海精密儀器儀表公司公司)；CX41倒置光學顯微鏡和OLS4100激光共聚焦顯微鏡(購自日本奧林巴斯醫療公司)。

P16，RB兔抗人多克隆抗體(購自Sigma公司)。

1.2患者臨床資料

本項研究選取2014年1月至2017年3月期間在我院內分泌科或普外科接受手術治療的TN患者251例，共獲取251個結節標本。其中99例患者為良性結節(男15例，女84例)，152例患者為惡性結節(男33例，女119例)。年齡為18-60歲，平均年齡為(39.25±7.63)歲；病程為1個月-17年，平均病程為(4.98±5.26)年。兩組患者一般臨床資料比較，無統計學差異，具有可比性。

1.3檢查方法

二維超聲檢查甲狀腺：患者取仰臥位，充分暴露頸部，多軸位掃描患者甲狀腺以及鎖骨上和頸部淋巴結。觀察甲狀腺結節數量、大小、位置、形態、回聲強度和均勻性，有無聲暈和囊變。

彩色多普勒超聲(CDFI)掃描甲狀腺：觀察甲狀腺結節的血流情況。

1.4手術切除方式

良性組：采取手術方式切除結節。

惡性組：甲狀腺乳頭癌患者完全切除病灶腺體和峽部以及部分對側腺體，同時清掃頸部淋巴結。甲狀腺濾泡狀腺癌完全切除病灶腺體和峽部以及部分對側腺體，若無淋巴結腫大，則不作處理。對于病灶微小的未分化癌，進行根治性切除。

1.5免疫組織化學檢查

病例樣本采集：按照病理編號調出我院病理科存檔甲狀腺癌患者的石蠟包埋組織切片。分別采用HE染色和免疫組織化學染色(SP免疫組化)。免疫組化法按照試劑盒說明書標明的實驗步驟進行。

脫嘌呤/嘧啶核酸內切酶1(Ape1)結果判定標準，將陽性細胞率分為：0分(陽性率為0)，1分(陽性率≤25%)，2分(陽性率25%-50%)，3分(陽性率50%-75%)，4分(陽性率>75%)。同時觀察細胞染色強度：0分(陰性)，1分(弱染色)，2分(中度染色)，3分(強染色)。將兩種評定分數相加，根據總分數將切片分為1-4級：1級(0-1分)，2級(2-3分)，3級(4-5分)，4級(6-7分)。1級和2級為Ape1低表達，2級和3級為Ape1高表達。

免疫組化結果評定標準：將經染色的病理片，放置在400倍視鏡下觀察，隨機選擇10個視野，并且將圖像輸入醫學影像處理分析系統，測定平均灰度值和面數密度值。

1.6統計學處理

2 結果

2.1兩組患者病理檢查結果

病理結果顯示，良性組患者大部分(61.62%)為結節性甲狀腺腫大患者，少部分(38.38%)為腺瘤患者。而惡性組患者大部分(63.82%)為乳頭狀癌患者，28.29%患者為濾泡癌，僅有7.89%為未分化癌。見表1。

表1 兩組患者病理檢查結果(n，%)

2.2二維超聲檢查結果

經二維超聲掃描甲狀腺結果，良性組患者結節邊界清晰，多見粗大鈣化灶，一般呈弧狀或環形排列，縱橫徑比<1，多數內部回聲以囊性為主，無淋巴結腫大。而惡性組患者，結節形狀不規則，邊界模糊，內部回聲多以低回聲為主，常見沙粒狀微小鈣化灶，縱橫徑比≥1，多見淋巴結腫大。

僅用邊界清晰度作為診斷TN良性結節的敏感性為100%，而診斷惡性結節的敏感性僅為41.45%。僅用內部回聲作為診斷TN良性結節的敏感性為96.97%，而診斷惡性結節的敏感性為94.08%。僅用微小鈣化灶作為診斷TN良性結節的敏感性為100%，而診斷惡性結節的敏感性為80.26%。僅用縱橫徑比作為診斷TN良性結節的敏感性為94.95%，而診斷惡性結節的敏感性僅為23.03%。見表2。

表2 二維超聲檢查結果(n，%)

2.3CDFI檢查結果

經CDFI檢查結果顯示，血流豐富度對于診斷TN良性結節的敏感性為100%，而診斷惡性結節的敏感性僅為66.45%。阻力指數對于診斷TN良性結節的敏感性為96.97%，而診斷惡性結節的敏感性僅為64.47%。見表3。

表3 CDFI檢查結果(n，%)

2.4免疫組化檢測結果

良性組患者不表達P16和RB癌基因，惡性組患者P16基因的陽性表達率為78.29%，RB基因的陽性表達率為81.58%。見表4。

2.5二維超聲檢查結果與惡性組患者P16、RB癌基因表達的關系

低回聲、微鈣化、縱橫徑比≥1的患者P16和RB癌基因的陽性表達率明顯高于陰性表達率，P<0.05。而結節邊界不清組患者RB癌基因的陽性表達率也高于陰性組，P<0.05。見表5。

表4 免疫組化檢測癌基因表達結果(n，%)

表5 超聲檢查結果與P16癌基因表達的關系(n，%)

注：*與陽性表達組比較，P<0.05；

2.6CDFI結果與惡性組患者P16、RB癌基因表達的關系

高阻力指數(≥0.7)、血流豐富的患者P16和RB癌基因的陽性表達率明顯高于陰性表達率，P<0.05。見表6。

表6 CDFI檢查結果與P16癌基因表達的關系(n，%)

注：*與陽性表達組比較，P<0.05；

3 討論

甲狀腺結節一般是通過觸診或者超聲檢查與周圍甲狀腺組織有明顯差別的孤立性病變，80%-90%的TN患者為良性結節，少部分患者可確診為惡性癌變[5]。有流行病學調查結果顯示，非缺碘地區，TN的發病率約為5%左右，由于發病前期沒有明顯的臨床指征，且病情進展緩慢，因此，漏診的可能性較高，應用超聲檢查確診率僅為20%-30%，而尸檢時，TN的發生率可高達65%以上；而甲狀腺癌的確診率更低[6,7]。

甲狀腺癌變是一個階梯性過程，包括癌基因突變、生長因子調控以及腫瘤組織的克隆[8]。經超聲檢查，發現甲狀腺結節邊界清楚、表面光滑、質地堅韌、有微小鈣灶、頸部淋巴結出現腫大情況時，可懷疑結節有癌變的可能[9,10]。本項研究結果也證實，經二維超聲掃描甲狀腺結果，良性組患者結節邊界清晰，多見粗大鈣化灶，一般呈弧狀或環形排列，縱橫徑比<1，多數內部回聲以囊性為主，無淋巴結腫大。而惡性組患者，結節形狀不規則，邊界模糊，內部回聲多以低回聲為主，常見沙粒狀微小鈣化灶，縱橫徑比≥1，多見淋巴結腫大。僅用邊界清晰度、內部回聲、微小鈣化灶或者縱橫徑比作為診斷TN良性結節的敏感性分別為100%、96.97%、100%、94.95%，而診斷惡性結節的敏感性分別為41.45%、94.08%、80.26%、23.03%。說明二維超聲雖然一直是臨床上最常用的診斷TN的手段，對于甲狀腺良性結節檢出的敏感性較高，但是對于診斷惡性癌變的敏感性相對較低。

甲狀腺癌是目前發病率增長速度最快的惡性腫瘤之一，病理分類較為復雜[11]，因此，采取的治療方案和預后也存在較大差異。近些年，隨著超聲技術的提高，以及CDFI的廣泛應用，TN的檢出率大大提高[12]。但是經常會有良性結節和惡性結節并存的情況，因此會增加惡性癌變的檢出困難[13]。進行CDFI檢查時，血流豐富度和阻力指數對于診斷TN良性結節的敏感性為100%、96.97%，而診斷惡性結節的敏感性僅為66.45%和64.47%。說明，CDFI雖然提高了甲狀腺結節的檢出率，但是對于惡性結節的辨別程度仍然不甚理想，漏診的幾率較大。P16和RB屬于抑癌基因，對細胞周期具有重要的調節作用[14]。有研究證實，檢測P16和RB基因是否突變可作為判斷甲狀腺癌變的重要參考指標之一。甲狀腺癌的發生發展與P16和RB蛋白的缺失密切相關，且缺失越嚴重，腫瘤的分化程度越差[15]。本項研究顯示，良性組患者不表達P16和RB癌基因，惡性組患者P16基因的陽性表達率為78.29%，RB基因的陽性表達率為81.58%。低回聲、微鈣化、血流豐富、縱橫徑比≥1的患者P16和RB癌基因的陽性表達率明顯高于陰性表達率，P<0.05。而結節邊界不清組患者RB癌基因的陽性表達率也高于陰性組，P<0.05。另外，高阻力指數(≥0.7)、血流豐富的患者P16和RB癌基因的陽性表達率明顯高于陰性表達率，P<0.05。

綜上所述，二維超聲和彩色多普勒超聲檢查，對判定甲狀腺的良性結節具有高敏感性，是鑒別甲狀腺良惡性結節和早期診斷甲狀腺癌的有效手段之一，但是對惡性結節的診斷率相對較低，這就需要從分子水平檢查并確診甲狀腺結節是否發生惡性病變，P16和RB基因在甲狀腺良性和惡性結節中的表達存在明顯差異，可作為判斷甲狀腺癌變的重要參考指標。