類風濕關節炎患者CD4+CXCR5+Tfh細胞水平的檢測及臨床意義

閆天懿，徐廷雙，李 萍

(吉林大學中日聯誼醫院 風濕免疫科，吉林 長春130033)

類風濕關節炎(RA)是以慢性多關節滑膜炎為主要臨床表現的自身免疫性疾病,以關節滑囊組織炎癥和關節破壞為主要特征[1,2]。RA的病因尚不清楚，可能與免疫紊亂、遺傳、感染、環境等有關。已知當抗原進入人體后，激活輔助性T淋巴細胞分泌細胞因子等炎性因子，激活B淋巴細胞分化為漿細胞，進而分泌包括抗環瓜氨酸多肽抗體(CCP)在內的大量免疫球蛋白，同時誘發炎癥反應[3]。Tfh細胞是一類位于淋巴濾泡的 CD4+T 細胞亞群，高表達趨化因子受體CXCR5，是淋巴濾泡趨化因子CXCL13 的受體,因此Tfh受CXCL13趨化而被募集到淋巴濾泡,從而刺激 B 細胞增殖、分化,并最終形成生發中心(GC)。Tfh細胞不但對于 GC 的形成和維持至關重要,而且還能夠維持、輔助B 細胞成熟、增殖，促使免疫球蛋白發生類別轉換[4,5]。已知CXCR5是Tfh細胞表面高表達標志性分子，CD4+CXCR5+Tfh可代表Tfh細胞水平[6]。目前Tfh細胞是否參與了RA關節破壞尚未見相關報道，同時Tfh是否參與了RA疾病活動也尚無定論[7-9]。本文將研究RA患者外周血CD4+CXCR5+Tfh細胞水平與實驗室指標及臨床癥狀的關系，并將首次根據關節骨侵蝕情況對RA進行分組，以探討CD4+CXCR5+Tfh細胞在RA發病及病情進展的作用，及其與RA骨破壞的關系。

1 資料與方法

1.1研究對象

本研究收集了2017年1月至2017年5月于吉林大學中日聯誼醫院風濕免疫科確診為RA并住院治療的30例患者的病例記錄及相關臨床資料，年齡22-68歲，其中男性5例，女性25例，病程1個月-33年。所有患者均符合1987年美國風濕病學會的RA分類標準[10]，排除感染、近期有手術外傷史者及處于妊娠、分娩或哺乳期的女性患者，或同時患有其他自身免疫性疾病及并發其他疾病者。同時選取本院同期體檢中心30名年齡和性別匹配的健康志愿者作為健康對照組(HC)，年齡22-65歲，平均(49.7±4.98)歲，其中男性5例，女性25例。

1.2方法

1.2.1Tfh細胞的流式檢測 用淋巴細胞分離液分離出外周血單個核細胞( peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，再以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次后，將細胞濃度維持在5×105個/mL左右,每管約500 μL。向流式管中加入抗體CD4，均為5 μL，CXCR5均為1.5 μL混勻。室溫孵育30 min，洗滌重懸細胞，使用BDFACSAria流式細胞儀( BD 公司，美國) 對處理好的標本進行檢測，每份標本至少獲取10000個細胞進行分析。用Flow Jo 7． 6 軟件(San Diego 公司，美國) 對獲得的數據進行分析。

1.2.2實驗室檢查 所有受試者采集空腹外周血，類風濕因子(RF)和C反應蛋白(CRP)采用乳膠增強免疫比濁法測定，紅細胞沉降率(ESR)采用魏氏法測定，抗環瓜氨酸多肽抗體(CCP)采用酶聯免疫吸附劑測定法(ELISA)測定，血清免疫球蛋白水平(IgA，IgG，IgM)、血清補體水平(C3,C4)采用速率散射免疫比濁法測定。

1.2.3臨床數據的收集 通過病歷回顧獲得RA患者姓名、性別、年齡、身高、體重、關節X線平片、關節彩超、腫 脹 關 節 數 ( number of swollen joints，SJC) 、壓痛關節數( number of tender joints，TJC)、患者健康評估問卷(HAQ)以及用藥情況。根據上述臨床數據，計算28個關節的疾病活動評分[the disease activity score in 28 joints，ESR-based，DAS28 (ESR)][11]；根據DAS28(ESR)將RA患者分為2組，即DAS28(ESR)>3.2為高中疾病活動度組(19例)，DAS28(ESR)≤3.2為低疾病活動或緩解組(11例)。根據RA患者關節X線平片，評估關節破壞情況；分為關節骨侵蝕組(15例)與無關節骨侵蝕組(15例)。

1.3統計學處理

2 結果

2.1RA患者和HC組外周血Tfh細胞水平的比較

采用流式細胞術檢測RA患者和HC外周血CD4+CXCR5+Tfh細胞水平結果顯示，RA患者外周血CD4+CXCR5+Tfh細胞占CD4+細胞的百分比7.70%(6.10%，9.70%)，明顯高于HC組5.85%(5.07%，7.35%)，差異具有統計學意義(P<0.05)(見表1)。

表1 RA患者和HC組外周血Tfh細胞水平的比較

2.2RA疾病活動性與Tfh細胞水平的關系

按照DAS28評分將RA患者分為高中疾病活動組和低疾病活動及緩解組，結果顯示高中疾病活動組CD4+CXCR5+Tfh細胞占CD4+細胞的百分比(9.64%±3.80%)，明顯高于健康對照組5.85%(5.07%，7.35%)(P=0.002)；高中疾病活動組CD4+CXCR5+Tfh細胞占CD4+細胞百分比(9.64%±3.80%)，明顯高于低疾病活動及緩解期組(6.85%±2.06%)(P=0.014) ；低疾病活動及緩解期組Tfh細胞水平與健康對照組差異無統計學意義(P=0.792)(見圖1)。

2.3RA患者關節骨侵蝕與Tfh細胞水平的關系

本研究按照是否存在關節骨侵蝕對RA患者進行分組研究，結果顯示有無關節骨侵蝕的RA患者組間及與健康對照組比較，CD4+CXCR5+Tfh細胞水平均無統計學差異(P>0.05)(見圖2)。相關性分析結果顯示，無關節骨侵蝕組中，CD4+CXCR5+Tfh細胞水平與血沉，HAQ，腫脹關節數,晨僵時間呈明顯正相關(P<0.05)(見表2)。在關節骨侵蝕組中，CD4+CXCR5+Tfh細胞水平與臨床及實驗室指標均無明顯相關性(P>0.05)(見表3)。

表2 無關節骨侵蝕RA患者外周血Tfh細胞水平與臨床及實驗室指標的相關性分析

注：“*”表示P<0.05

表3 關節骨侵蝕RA患者外周血Tfh細胞水平與臨床及實驗室指標的相關性分析

3 討論

RA是一種發病機制尚不清楚的慢性自身免疫性疾病，普遍認為其發病可能與多種免疫細胞如抗原特異的T、B 淋巴細胞、抗原提呈細胞及自身抗體等相互作用有關[3]。Tfh細胞是近年來發現的一種CD4+T細胞亞群，其主要位于次級淋巴器官的生發中心中，高表達標志性分子CXCR5，對抗原特異性B細胞在GC中的增生和分化起主要的輔助功能[12，13]。研究表明Tfh細胞參與多種自身免疫性疾病的發病，如系統性紅斑狼瘡(SLE)、重癥肌無力(MG)、骨髓增生異常綜合征(MDS)[13]。近年來的研究報道[14，15]認為Tfh細胞可能在RA的發生和發展中也發揮一定作用，例如Tfh細胞可引起B淋巴細胞在生發中心增殖進而產生大量的抗CCP抗體等免疫球蛋白。本研究檢測了RA患者外周血CD4+CXCR5+Tfh細胞水平，結果顯示，RA患者Tfh細胞水平明顯高于健康對照組，這一結果與安樂美[7]等人在RA領域的研究結果相似。上述結果表明Tfh細胞在RA患者中的表達失調，提示其可能參與了RA的發病機制。但Costantino AB[9]等人的研究發現，RA患者與健康對照組的Tfh細胞水平不存在差異，可能與患者樣本量少，納入RA患者存在個體差異等因素有關。

本研究進一步比較疾病活動情況不同RA患者與健康對照組Tfh細胞水平的差異，發現高中疾病活動組CD4+CXCR5+Tfh細胞水平顯著高于低疾病活動及緩解組和健康對照組，而低疾病活動及緩解組與健康對照組無差異。這一結果與Zhang Y[16]等人在RA領域的研究結果相似，提示Tfh細胞主要在疾病高度活動時參與免疫反應。這可能與CXCR5/CXCL13信號傳導通路相關[17]。大量的研究表明，白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α等炎性因子可調控血清CXCL13參與炎性反應[18,19]。 Nayak LM等人的研究表明，剔除TNF-α基因或其受體TNFRp55基因的小鼠體內CXCL13的表達出現了下降,說明TNF-α與其受體的結合對CXCL13的表達有上調的作用[17]。此外，張銘明[20]等人的研究發現，RA患者血清 CXCL13水平與細胞因子TNF-α、IL-6正相關。隨著RA病情進展、病理改變惡化，巨噬細胞、成纖維細胞等多種炎癥細胞釋放增多，產生大量炎性因子，致使CXCL13水平升高[21]，因此Tfh細胞受 CXCL13 趨化而被募集到淋巴濾泡,促進Tfh細胞向B淋巴細胞和生發中心遷移，Tfh細胞可引起B淋巴細胞在生發中心增殖進而產生大量的抗CCP抗體等免疫球蛋白，促進RA的發生和發展。安樂美[22]等人的研究發現RA患者血清CXCL13水平明顯升高，且增高幅度與疾病活動度相關。結合本研究結果,RA活動期患者體內Tfh細胞水平升高，可能與患者體內活躍的免疫狀態相關。因此，RA患者外周血Tfh細胞水平很可能成為評估RA患者疾病嚴重程度的參考指標之一。

大量的研究已證明[23]抗CCP抗體水平與RA骨侵蝕程度相關，因此本研究進一步根據關節骨侵蝕情況對RA患者進行分組，探討Tfh細胞是否參與了RA的關節破壞情況。發現雖然關節骨侵蝕組患者Tfh細胞水平與無關節骨侵蝕組無明顯差異，但是在無關節骨侵蝕組中，RA患者CD4+CXCR5+Tfh細胞水平與血沉、腫脹關節數、HAQ、晨僵時間等反應疾病活動性的指標正相關，而在關節骨侵蝕組中未發現此相關性。這可能與關節骨侵蝕發生過程中炎癥細胞釋放增多，產生更多的CXCL13相關[22]。提示CD4+CXCR5+Tfh細胞可能在RA疾病早期尚未發生關節骨破壞時發揮重要作用，促進了關節骨侵蝕的發生。

綜上所述，本研究發現RA患者中外周血Tfh細胞水平顯著升高，且Tfh細胞主要在疾病高度活動時參與免疫反應。此外，本研究發現外周血CD4+CXCR5+Tfh細胞可能在RA疾病早期尚未發生關節骨破壞時發揮重要作用。這些研究結果表明Tfh細胞可能通過多種途徑參與了RA的發生和發展,可能在RA疾病早期，即尚未發生關節骨侵蝕階段的病情進展中發揮了重要作用，及時阻斷該炎癥因子，有可能阻止RA骨破壞的發生。