肺癌細胞血管外游走過程中血管內皮通透性的變化

劉 楠,辛 華,張樂寧,聶海英

(吉林大學中日聯誼醫院 胸外科,吉林 長春130033)

肺癌血行轉移是一個高度選擇性的非隨機生物學過程，包括肺癌細胞與血管內皮細胞及細胞外基質之間一系列復雜的生物學作用，其中肺癌細胞向血管外游走是肺癌血行轉移的重要環節。為此，我們在體外模擬構建了肺癌細胞血行轉移中的血管外游走過程，對肺癌細胞的血管外游走途徑加以探討。

1 材料與方法

1.1實驗所用細胞

在包被有明膠的細胞培養皿上培養人臍靜脈內皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVEC)；3種肺癌細胞分別為：LK-2、A549、RERF-LC-KJ。

1.2血管內皮單細胞層的制備

將3×104個HUVEC加入預先制備膠原凝膠層的細胞培養皿內，培養1周，經Giemsa染色，在光鏡(40×)下觀察血管內皮單細胞層是否已完全融合生長。同時將細胞培養皿放入到裝有正負電極的培養容器內，與電阻測定儀相連，連續記錄血管內皮單細胞層的電阻值。

1.3連續記錄肺癌細胞血管外游走過程中血管內皮單細胞層的電阻變化

將培養有單層血管內皮細胞的細胞培養皿放入裝有正負電極的培養容器內，與電阻測定儀相連，記錄血管內皮單細胞層的電阻值；然后分別將1×105個肺癌細胞(LK-2、A549、RERF-LC-KJ)加入細胞培養皿內，連續監測血管內皮單細胞層的電阻變化。

1.4數據統計處理

2 結果

2.1血管內皮單細胞層的確認

經Giemsa染色，在光鏡(40×)下觀察到血管內皮單細胞層已完全融合生長(圖1)。同時測定血管內皮單細胞層的電阻值為9.68±2.05 ohm/cm2，與相關研究報道的數值基本一致[1]，可以認為HUVEC已完全融合生長，在膠原凝膠表面制備成血管內皮單細胞層。

圖1 完全融合生長的血管內皮單細胞層(Giemsa染色，40×)

2.2肺癌細胞血管外游走過程中血管內皮單細胞層的電阻變化

因為血管內皮單細胞層的電阻可以用來說明血管的通透性[2]，為此我們連續監測了肺癌細胞(LK-2、A549、RERF-LC-KJ)游走過程中血管內皮單細胞層的電阻變化。結果證實在血管內皮單細胞層表面加入肺癌細胞后，會急速出現血管內皮單細胞層的電阻下降，數分鐘后下降至最底點，然后緩慢上升(圖2)。

圖2 肺癌細胞血管外游走過程中血管內皮單細胞層的電阻變化

我們發現肺癌細胞LK-2、A549、RERF-LC-KJ均可以穿過血管內皮細胞游走至血管外，同時引起血管內皮單細胞層的電阻下降；與A549、RERF-LC-KJ相比，LK-2游走過程中血管內皮單細胞層的電阻下降幅度更大，差異有統計學意義(P<0.05)，這也證明了LK-2比A549、RERF-LC-KJ具有更強的穿過血管內皮的能力(圖3)。

注：*LK-2與A549、RERF-LC-KJ相比 P<0.05(n=6)圖3 各種肺癌細胞血管外游走過程中引起的血管內皮單細胞層電阻下降

3 討論

肺癌血行轉移是一個高度選擇性的非隨機生物學過程，包括肺癌細胞與血管內皮細胞及細胞外基質之間一系列復雜的生物學作用，其中肺癌細胞向血管外游走是肺癌血行轉移的重要環節[3]。我們之前的研究成功在體外模擬構建了肺癌細胞血行轉移中的血管外游走狀態，發現進入血液循環的肺癌細胞在靶器官穿過血管內皮的前提是肺癌細胞與血管內皮細胞的特異性粘附，這也說明肺癌的血行轉移具有器官組織特異性；并證實了粘附后的肺癌細胞可以穿過血管內皮游走至血管外。但肺癌細胞是如何穿過血管內皮的目前還不清楚，我們此次研究的目的就是對肺癌細胞的血管外游走途徑加以探討。

最初有學者認為血管內皮細胞對腫瘤細胞的吞噬和釋放是腫瘤細胞穿過血管內皮的途徑；但近些年的研究越來越不支持這種觀點，有文獻報道急性肺損傷的狀況下腫瘤的肺部轉移病灶明顯增多，這提示肺組織損傷導致的肺毛細血管通透性增加可能與腫瘤的血行轉移過程關系緊密[4]。因為體外測定血管內皮單細胞層的電阻可以用來說明血管的通透性，為此本研究連續監測了肺癌細胞(LK-2、A549、RERF-LC-KJ)游走過程中血管內皮單細胞層的電阻變化，結果證實在血管內皮單細胞層表面加入肺癌細胞后，會急速出現血管內皮單細胞層的電阻下降，這種現象證實了肺癌細胞的血管外游走過程與血管通透性增加密切相關。因為血管通透性的增加是由于血管內皮細胞收縮、細胞間隙增大導致，這也就恰恰說明了肺癌細胞是穿過血管內皮細胞間隙進行血管外游走。實驗中我們證實肺癌細胞LK-2、A549、RERF-LC-KJ均可以穿過血管內皮細胞游走至血管外，同時引起單層血管內皮細胞的電阻下降；與A549、RERF-LC-KJ相比，LK-2游走過程中單層血管內皮細胞層的電阻下降幅度更大，證明了LK-2比A549、RERF-LC-KJ具有更強的穿過血管內皮間隙的能力。

我們的研究能夠初步揭示肺癌細胞血管外游走過程中與血管內皮細胞的相互作用機制，并為以后的研究打下基礎。