亞急性期靜脈注射人骨髓間充質干細胞對腦梗死大鼠神經功能的影響

遲魯梅,龔秀玲，于 驍,吳坤軍,沈 靜,高 宇*

(1.吉林大學中日聯誼醫院 神經內科，吉林 長春130033；2.上海市嘉定區南翔醫院 神經內科，上海201800)

在我國，腦梗死是導致死亡和成人致殘的第一位原因。盡管醫學上對腦梗死的治療已取得了不斷的進步，每年仍至少有200萬新發的腦梗死患者，卒中死亡占所有死亡原因的22.45%[1]。近年來，骨髓間充質干細胞(BMSCs)治療為腦梗死患者帶來了新的希望。目前對BMSCs的研究主要在急性期，本實驗主要探討亞急性期靜脈給予人骨髓間充質干細胞(hBMSCs)對腦缺血再灌注大鼠神經功能的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料

hBMSCs(ScienCell公司，No.7500;ScienCell),高糖DMEM培養液(CEFOgro BMMSC)，胎牛血清(SH30084.03,Hyclone)，Trypsin-EDTA(Gibco,Canada)，雄性SD大鼠(遼寧長生生物技術有限公司)，冰凍切片機(Lecia CM1900)，Image J軟件(Image J;NIH,Bethesda，MD)。

1.2方法

1.2.1細胞培養 hBMSCs原代細胞種于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM 培養基中，將細胞放于37℃，5%二氧化碳的標準濕化孵育箱中培養。當細胞生長達到80%時進行傳代。取第3-5代細胞進行實驗。

1.2.2腦缺血再灌注模型的制備和實驗分組 選用250-300克的雄性SD大鼠作為實驗對象。所有大鼠的飼養溫度為(20±2)℃，自由攝食和飲水，保持12小時輪換開燈關燈的作息時間，大鼠在大腦中動脈閉塞(MCAO)模型制備前1天禁食，模型制備前4小時禁水。采用線栓法[2]制備大腦中動脈閉塞(MCAO)模型。造模成功后2小時，拔出線栓，實現再灌注。

將大鼠隨機分為2組，對照組(MCAO模型)和治療組(MCAO+hBMSCs)，兩組大鼠分別在再灌注14天注射等量的2 mlPBS和2×106個hBMSCs。實驗過程中不使用免疫抑制劑。

1.2.3大鼠行為功能測試 實驗大鼠的行為功能測試由不了解實驗分組的實驗員進行。mNSS評分，limb placement 評分，Corner test 評分在造模后1天、14天、21天、35天、42天進行。mNSS評分參照王利平[3]，Limb placement評分參照M De Ryck等[4]，Corner test參照Zhang等[5]。

1.2.4梗死體積的測定 造模后第42天，所有大鼠麻醉后，通過心臟灌洗冰鹽水處死，取出腦組織放于4%的福爾馬林中浸泡24小時，然后浸入30%的蔗糖溶液中，48小時后，待腦組織沉底后，取出腦組織，放入-70℃冰箱中保存。24小時后取出冰凍的腦組織，在冰凍切片機中切成30 μm的薄片。進行Nissl染色。通過Image J軟件測量梗死體積。梗死體積的表示方法為：病灶的體積/對側大腦半球的體積。

1.3統計學方法

采用 SPSS 20.0 統計軟件進行分析,數據以均數±標準差(mean±SD) 表示,采用t檢驗的方法對兩組進行統計分析,以P<0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1兩組大鼠的mNSS功能評分結果

對照組和實驗組在第1，14，21，35，42天均進行mNSS評分，兩組在各個時間點均沒有顯著差異(P>0.05)。兩組比較結果見表1。

表1 各組大鼠間mNSS評分結果

2.2Limbplacement功能評分的結果

實驗組和對照組在各個時間的Limb placement評分沒有顯著差異(P>0.05)。結果見表2。

表2 兩組大鼠間limbplacement評分結果

2.3Cornertest評分結果

兩組大鼠在各個時間點的Corner test功能評分沒有顯著差異(P>0.05)。結果見表3。

表3 兩組大鼠間的Corner test評分結果

2.4Nissl染色

Nissl染色正常腦組織為淺紫色，梗死區顏色發白。如圖1，2。結果用Image J軟件計算梗死體積和對側大腦半球的體積的百分比表示。通過t檢驗，兩組之間梗死體積百分比沒有顯著差異(P>0.05)，結果如表4。

表4 兩組大鼠梗死體積百分比的結果

圖1 對照組Nissl染色的結果

圖2 hBMSCs治療組Nissl染色的結果

3 討論

在世界范圍內，腦卒中是導致長期殘疾的主要原因。目前，尚沒有太多有效的方法來促進卒中后患者的神經功能康復。近年來，細胞移植為腦卒中患者的治療帶來了新的希望。尤其是BMSCs。它們能夠識別并趨附腦損傷部位，一旦到達損傷部位，能夠分泌促進腦組織恢復的因子[6]。此外，它們具有低免疫源性，能夠自體移植而不涉及倫理學問題。大量研究表明，BMSCs能夠改善腦缺血大鼠的神經功能[7-9]。

BMSCs移植的最佳時間取決于腦梗死后周邊環境的動力學改變。大多數動物實驗中，細胞移植的時間多為腦缺血后24小時或更短的時間[7-9]。但在實際的臨床病人中，由于倫理學及免疫源性等原因，多采用自體BMSCs治療。急性期患者的不良狀態以及BMSCs的較長的培養周期為急性期的細胞治療提供了阻礙。卒中病人的細胞治療更可能在亞急性期或慢性期進行。亞急性期細胞移植的效果目前尚沒有統一的定論。王利平等[3]認為，亞急性期(造模后7天)給予BMSCs能夠減少微環境對宿遷細胞的損害，從而減小梗死體積，改善神經功能。Bhimashankar Mitkaria等認為亞急性期(造模后7天)給予MSCs雖然能促進血管再生[10]，但是并不能帶來神經功能的好轉[10-12]。但是，也有研究[13,14]表明，造模后7天給予BMSCs能顯著的改善大鼠的運動和感覺功能。目前關于缺血再灌注后14天給予BMSCs治療報道較少。為了探索這一時期靜脈注射BMSCs對腦缺血大鼠的影響，本實驗在MCAO后第14天給予hBMSCs治療，并用了三組行為功能測試來評估MCAO大鼠的運動、感覺的改善。這三個檢查分別是mNSS評分，limbplacement評分和Corner test評分。我們選這三種行為功能檢測方法是因為它們對腦梗死大鼠的感覺和運動損傷比較敏感[4，5]，而且比較適用于長期的觀察評估[5]，不易受反復測試的影響。結果表明，造模14天給予hBMSCs靜脈治療后，一直到第42天并未見到治療組大鼠的神經功能的改善。同時，通過Nissl染色對兩組大鼠的梗死體積進行對比，也沒有見到明顯的統計學差異。這說明，腦梗死后14天后給予靜脈注射hBMSCs并不能改善實驗大鼠的神經功能。這與其他部分亞急性期和慢性期治療的研究結果是不一致的[7，15]。應該注意的是，在很多研究[7,16]中，BMSCs注射后的幾天內很快就能看到行為功能的改善，這種改善更多的是與急性期神經保護作用或者水腫以及炎癥反應的減退有關，而不是單純的感覺和運動的修復。除了治療的時間對治療效果的影響外，靜脈給予細胞的數量也是很重要的。通過對60項基礎研究的meta分析結果表明，注射的細胞數量和治療效果呈明顯的劑量相關性[17]，增加細胞注射的數量有可能促進神經功能的改善。此外，盡管大多數的研究[18,19]認為異體BMSCs沒有免疫排斥反應或者很弱的免疫反應，目前尚缺乏自體和異體BMSCs在免疫反應、動力學改變以及治療效果方面的合適的對照研究。異體細胞的給入是否也影響了BMSCs治療的效果也需要進一步的探索。

本研究證實，亞急性期給予hBMSCs并不能改善腦梗死的神經功能，其移植治療的時間窗需要更多的基礎研究來進一步確定。