miR-320a靶向Rab11a調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的研究

石少敏,趙建軍，于杜鵑,宋玉明

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 呼吸內(nèi)科,吉林 長春130033)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是臨床常見惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均居我國所有惡性腫瘤首位[1]。盡管以吉非替尼、恩度等為代表的新型靶向藥物在NSCLC治療中取得令人鼓舞的成效，但NSCLC患者的遠(yuǎn)期生存率仍不盡如人意[2]。因此，進(jìn)一步探索NSCLC的發(fā)病機制，提高NSCLC的臨床療效是臨床亟待解決的問題。微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，可通過靶向調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中多個關(guān)鍵基因，參與細(xì)胞增殖及凋亡等病理生理過程，是腫瘤的潛在治療靶點[3]。miR-320a是新發(fā)現(xiàn)的miRNA成員，定位于人體染色體8p21.3上[4]。研究表明miR-320a在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中起到類似抑癌基因的作用，但其分子機制尚未完全明確[5]。Rab11a屬于Rab小分子GTP酶家族的成員，是內(nèi)吞再循環(huán)過程中的關(guān)鍵因子。既往研究證實，Rab11a表達(dá)變化可明顯影響腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡，提示調(diào)控Rab11a表達(dá)可能是NSCLC靶向治療的新思路[6]。課題組前期利用miRNA靶基因預(yù)測軟件證實，miR-320a與Rab11a存在結(jié)合位點，提示二者可能具有靶向關(guān)系。但miR-320a是否可通過靶向Rab11a調(diào)控NSCLC細(xì)胞增殖尚未可知。本研究旨在探討miR-320a靶向Rab11a對NSCLC細(xì)胞增殖的影響，以期為臨床診療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購于美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)；RPMI1640培養(yǎng)基、PBS、胰蛋白酶、胎牛血清購于Gibco公司；MTT試劑盒購于博士德生物有限公司；Rab11a單克隆抗體購于美國Abcam公司；雙熒光素酶試劑盒購于美國Promega公司；Annexin V-FIFC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于凱基生物；Neg-miR、si-Rab11a、pre-miR-320a、anti-miR-320a購于Ambion公司。

1.2細(xì)胞分組常規(guī)復(fù)蘇A549細(xì)胞，將細(xì)胞重懸浮于含有1%雙抗+10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期的A549細(xì)胞并接種于6孔培養(yǎng)板中，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個/孔，細(xì)胞隨機分為4組，即Neg-miR組、si-Rab11a組、pre-miR-320a組、anti-miR-320a組，各組分別轉(zhuǎn)染Neg-miR、si-Rab11a、pre-miR-320a、anti-miR-320a，之后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)染結(jié)束后進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦\用生物學(xué)信息軟件預(yù)測miR-320a的靶基因為Rab11a(http:/ /www.targetscan.org/)。以人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞基因組DNA為模板，構(gòu)建野生型Rab11a 3’-UTR(Rab11a-wt)質(zhì)粒、突變型Rab11a 3’-UTR(Rab11a-Mut)。收集對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至2×105cells/well，將Rab11a-wt、Rab11a-Mut與Neg-miR或pre-miR-320a共轉(zhuǎn)染至A549，將細(xì)胞37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)48 h；測定細(xì)胞熒光素酶活性，海腎質(zhì)粒熒光值作為內(nèi)參。

1.4Rab11a蛋白表達(dá)檢測收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，測定樣品蛋白濃度，取適量樣品行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，將膜置于5%封閉液4℃封閉4 h，后依次加入Rab11a單克隆抗體(1∶2 000)、二抗(1∶500)孵育，按ECL試劑盒說明書行電化學(xué)發(fā)光檢測。

1.5細(xì)胞增殖活性檢測收集各組細(xì)胞，將細(xì)胞置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)24 h、36 h及72 h時，離心棄上清每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，繼續(xù)37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)4 h，離心棄上清，加入DMSO(100 μl/每孔)，振蕩至結(jié)晶物充分溶解，采用全自動酶標(biāo)儀測450 nm處吸光值(OD值)。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，組間比較用單因素方差檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1驗證miR-320a對Rab11a的靶向作用

生物信息學(xué)工具網(wǎng)站http://www.microRNA.org檢測結(jié)果顯示，miR-320a與Rab11a 3’UTR之間存在結(jié)合位點(見圖1A)。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，pre-miR320a與Rab11a-WT共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光活性顯著低于Neg-miR與Rab11a-WT共轉(zhuǎn)染(P<0.05)；pre-miR-320a或Neg-miR與Rab11a-MUT共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光活性比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(見圖1B)。

(1A為miRNA靶基因預(yù)測軟件檢測結(jié)果；1B為雙熒光酶素檢測試驗結(jié)果)

注：aP<0.05，與Neg-miR組比較

圖1雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-320a對Rab11a的靶向作用

2.2Westernblot檢測Rab11a蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pre-miR-320a和si-Rab11a后Rab11a蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，轉(zhuǎn)染anti-miR-320a后Rab11a蛋白表達(dá)顯著增高(P<0.05)(見圖2)。

2.3MTT法檢測細(xì)胞增殖

MTT結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pre-miR-320a和si-Rab11a后細(xì)胞增殖活性顯著降低(P<0.05)，轉(zhuǎn)染anti-miR-320a后細(xì)胞增殖活性顯著增高(P<0.05)(見圖3)。

注：aP<0.05，與Neg-miR組比較；bP<0.05，與si-Rab11a組比較；cP<0.05，與anti-miR-320a組比較

圖2各組Rab11a蛋白表達(dá)比較

圖3 各組細(xì)胞增殖活性比較

3 討論

miR-320a已被證實參與多種惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[8]。Yang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，浸潤性乳腺癌組織中miR-320a表達(dá)與腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，且miR-320a表達(dá)越低者總體生存時間越短。李沛等[10]研究顯示，利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-320a表達(dá)水平，可顯著抑制細(xì)胞中β-catenin、Vimentin、N-cadherin、MMP-2及MMP-9蛋白表達(dá)，同時抑制細(xì)胞增殖活性、侵襲能力及轉(zhuǎn)移能力。Zhang等[11]研究表明，NSCLC組織中miR-320a表達(dá)顯著低于癌旁正常組織(P<0.05)。上述研究提示，miR-320a在包括NSCLC在內(nèi)的多種惡性腫瘤細(xì)胞中均發(fā)揮類似抑癌基因的功能，但其作用機制尚未完全明確。

受體介導(dǎo)的胞吞作用是動物細(xì)胞從胞外攝取大分子物質(zhì)的重要方式[12]。Rab11a作為胞吞再循環(huán)的關(guān)鍵因子，參與物質(zhì)胞內(nèi)運輸、循環(huán)過程。研究發(fā)現(xiàn)，Rab11a參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其機制可能與Rab11a調(diào)控腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)運輸有關(guān)[13]。Dong等[14]研究證實，Rab11a在NSCLC組織中高表達(dá)，且其高表達(dá)與TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良有關(guān)(P<0.05)；過表達(dá)Rab11a可顯著促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，同時抑制細(xì)胞凋亡。上述研究提示，Rab11a可能是NSCLC基因治療中的一個重要靶點。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pre-miR-320a可顯著下調(diào)A549細(xì)胞中Rab11a表達(dá)，而轉(zhuǎn)染anti-miR-320a則可顯著上調(diào)A549細(xì)胞中Rab11a表達(dá)，提示miR-320a與Rab11a之間存在某種負(fù)向調(diào)控機制。進(jìn)一步利用基因軟件預(yù)測和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實，miR-320a可通過作用于Rab11a 3’UTR，實現(xiàn)對Rab11a的靶向作用。本研究還觀察到，轉(zhuǎn)染pre-miR-320a后，且隨著Rab11a表達(dá)的降低，A549細(xì)胞增殖活性顯著降低，提示過表達(dá)miR-320a可通過靶向抑制Rab11a調(diào)控NSCLC細(xì)胞增殖，反之亦然。故推測，miR-320a靶向調(diào)控其下游靶基因Rab11a是其介導(dǎo)NSCLC細(xì)胞增殖的主要分子機制。

綜上所述，miR-320a可通過靶向Rab11a調(diào)控NSCLC細(xì)胞增殖。但miR-320a是否還通過靶向其他多個下游靶基因參與NSCLC的發(fā)生與發(fā)展？尚未可知，仍有待進(jìn)一步深入研究。