糖尿病腎病患者尿液miR-192的表達及臨床意義

陳月英，羅曉星，謝詠梅，李金一，劉 敏

(中國人民解放軍第四五八醫院：1.內分泌科；2.干部病房，廣州 510062)

糖尿病腎病(DN)是2型糖尿病(T2DM)嚴重的微血管并發癥之一。隨著近年來全球范圍T2DM的發病率呈逐年上升趨勢，DN已成為導致終末期腎臟病(ESRD)的首要病因[1]。DN發病機制復雜，目前尚未完全闡明；且目前針對DN的早期檢測手段還存在不足。因此，能夠早期發現、預測DN，對于及時治療或延緩DN的進展，改善DN患者預后具有非常重要的意義。已有的研究證實，尿液中蘊藏豐富的與腎臟疾病相關的生物學信息，因此長期以來尿液檢測為臨床腎臟疾病診斷和療效監控的重要手段[2]。微小RNA(miRNA) 是一類內源性的、非編碼的單鏈小分子RNA。研究證實，miRNA在血清、尿液、唾液，以及其他體液中穩定表達。通過調控多個上游基因表達和下游蛋白翻譯，在人體多種生理病理過程起著非常重要的作用[3]。有研究表明，miR-192能調控系膜細胞的增殖、凋亡，促進腎纖維化，與DN的發生、發展有關[4]。本研究旨在通過檢測T2DM患者尿液miR-192水平，研究其與T2DM患者發生DN的相關性，探討尿液miR-192對DN早期診斷和療效判斷的臨床價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2014年6月至2016年12月在本院內分泌科接受治療的140例T2DM患者作為研究對象，年齡57～67歲，平均(52.7±6.4)歲；其中男86例，女54例。所有納入研究患者均符合1999年WHO制訂的T2DM診斷標準。排除標準：1型糖尿病、各種急慢性感染性疾病、惡性腫瘤、心腦血管意外，DM以外其他腎臟疾病。根據DM防治專家共識(2014年版)[5]，按照24 h尿清蛋白定量(24 h-UAE)將140例T2DM患者分為3組：正常蛋白尿組(24 h-UAE<30 mg) 55例，微量蛋白尿組(24 h-UAE<300 mg) 48例，大量蛋白尿組(24 h-UAE≥300 mg) 37例。另選擇30例健康體檢者作為對照組。本研究經過醫院倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 Trizol Reagent 購自Invitrogen公司；miRNA SYBR Green PCR Kit、miScript Reverse Transcription Kit、miR-192引物和U6引物序購于購自天根生化科技(北京)有限公司；Nanodrop?ND-1000微量紫外分光光度計購自美國NanoDrop公司；Prism?7300實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；-80 ℃低溫冰箱購自日本三洋公司。

1.3方法

1.3.1尿液標本收集 每個研究對象收集新鮮晨尿20 mL，4 ℃環境下，于離心機上2 000 r/min離心20 min，取上清液置于-80 ℃冰箱保存待用。

1.3.2實時熒光定量PCR(RT-PCR) (1)總RNA提取：采用Trizol試劑對尿液總RNA進行提取。每份尿液標本加入1.5 mL 的Trizol進行裂解。經過RNA分相、沉淀、洗滌、溶解后。使用Nanodrop測定RNA 在分光光度計260、280和230 nm的吸收值，對提取的RNA濃度和純度進行評估。用甲醛電泳試劑進行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA 純度及完整性。(2) 逆轉錄(RT)反應：按照miScript Reverse Transcription Kit[天根生化科技(北京)有限公司]操作步驟構建10 μL反應體系：RNA 3 μL，1×mirVana RT Primer 1 μL，Array script Enzyme Mix 0.4 μL，mirVana RT Buffer(5×) 2 μL，加RNase-free water至總體積10 μL。反應條件：37 ℃反應60 min； 85 ℃滅活5 min。(3)RT-PCR反應：按照miRNA SYBR Green PCR Kit[天根生化科技(北京)有限公司]操作步驟進行RT-PCR反應。構建20 μL反應體系：5×Golden HS SYBR Green qPCR Mix 4 μL，PCR Forward Primer(20×) 1 μL，PCR Reverse Primer(20×) 1 μL，1×cDNA模板1～2.5 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，加入ddH2O至總體積20 μL。反應條件：95 ℃ 5 min； 循環條件(95 ℃，10 s；60 ℃，20 s；72 ℃，10 s) 40個PCR循環。以U6 snRNA作為內參，實驗重復3次。數據采用2-ΔΔCT想對定量法法進行分析。

1.3.3生化指標檢測 C肽、24 h-UAE檢測采用放射免疫分析法(RIA法)，血糖、血肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)、胱抑素C用全自動生化分析儀測定。腎小球濾過率(eGFR) =186×[SCr(mg/dL)]-1.54×[年齡(歲)]-0.203×(0.742×女性)。

2 結 果

2.1各組間臨床資料比較 對照組和T2DM 3組間年齡、性別構成差異無統計學意義(P>0.05)；正常蛋白尿組、微量蛋白尿組、大量蛋白尿組3組間糖尿病病程、SCr、胱抑素C、eGFR比較差異均有統計學意義(P<0.05)；而空腹血糖、糖化血紅蛋白在T2DM 3組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)；大量蛋白尿組24 h-UAE、BUN要高于微量蛋白尿組(P<0.05)，而在正常蛋白尿組和微量蛋白尿組之間，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2各組尿液miR-192的表達水平比較 通過RT-PCR檢測各組患者尿液中miR-192表達的CT值。以U6為內參基因，經2-ΔΔCT法計算，結果顯示：正常蛋白尿組、微量蛋白尿組、大量蛋白尿組患者尿液miR-192表達明顯高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。正常蛋白尿組、微量蛋白尿組、大量蛋白尿組間尿液miR-192表達比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1、表2。

2.3尿液miR-192水平與DN臨床指標間的相關性分析 相關性分析結果顯示，DN患者尿液miR-192水平與SCr、BUN、24 h尿蛋白和胱抑素C呈正相關(P<0.05)。而與糖尿病病程、空腹血糖和糖化血紅蛋白無相關性(P>0.05)，見表3。

表1 各組臨床資料比較

注：與微量蛋白尿組相比，*P<0.05；與正常蛋白尿組相比，▲P<0.05；-表示無數據

注：A為尿液總RNA；B為溶解曲線；C為擴增曲線

圖1 miR-192PCR反應圖表2 各組尿液miR-192表達相對值比較

注：與對照組比較,*P<0.05；與正常蛋白尿組比較,▲P<0.05；與微量蛋白尿組比較,#P<0.05

表3 尿液miR-192水平與DN患者臨床指標的相關性分析結果

2.4尿液miR-192水平對DN的預測價值 以24 h-UAE和eGFR反應腎損傷標準的數值為因變量，尿液miR-192水平值作為自變量進行線性回歸分析。結果顯示尿液miR-192水平與DN有相關性，是T2DM患者發生DN的獨立預測因子(P<0.05)，見表4。

表4 尿液miR-192與24 h-UAE和eGFR的回歸分析

3 討 論

在人體細胞中，miRNA能通過堿基互補配對的形式與靶基因的3′ UTR部分或完全互補，剪切靶基因的轉錄產物或者直接抑制轉錄產物的翻譯，最終在轉錄后水平調控靶基因的表達。miRNA的發現揭示了一種新的基因表達調控方式，即不同miRNA和靶基因之間能夠形成復雜的調控網絡，發揮精細凋控功能基因表達的作用[6]。目前針對miRNA的生物功能學研究證實，miRNA參與包括細胞發育、生長、增殖、分化、凋亡、免疫、腫瘤發生等一系列生理病理過程，并且在腎臟生理功能調控和腎臟相關疾病如DM發生、發展中發揮重要調控作用[7]。由于miRN具有生物遺傳和種屬表達保守性的特點，在生物發育的不同階段和不同組織中均表達不同種類miRNA分子。尤為值得關注的是，在各種疾病病變細胞、組織，以及患者本身各種體液中均能夠發現與所患疾病相關的miRNAs異常表達[8]。目前研究顯示在腎臟疾病患者尿液中均存在穩定和特定表達的miRNA，對腎病的診斷和預后評估均顯示出潛在的臨床價值，有望成為腎病理想的無創檢測生物標志物[9]。

miR-192是在腎臟組織中，尤其在系膜細胞中特異性表達的miRNA。有研究表明miR-192與缺血再灌注腎損傷、腎臟纖維化與DN過程密切相關。KATO等[10]發現miR-192在DN大鼠腎小球內呈過量表達，進一步研究發現miR-192通過下調E-box阻抑蛋白來控制腫瘤壞死因子(TGF)-β1 誘導的ColIα2 表達，進而參與DN的細胞外基質蛋白蓄積進程。PUTTA等[11]研究發現，通過LNA-anti-miR-192抑制DN小鼠miR-192的表達能促進Zeb1/2表達，抑制膠原、TGF-β、纖維連接蛋白的表達。而且LNA-anti-miR-192能夠明顯降低糖尿病小鼠蛋白尿水平。CHIEN等[12]研究發現，伴有明顯蛋白尿的DN患者血清miR-192要高于正常蛋白尿DN患者。且這種高表達與DN疾病的進程有關。本研究采用RT-PCR檢測不同病程DN患者尿液miR-192的表達水平。結果顯示DN患者尿液miR-192表達顯著高于健康人。且隨著DN患者尿液中蛋白水平的增加，其尿液miR-192表達也明顯增加(即大量蛋白尿組>微量蛋白尿組>正常蛋白尿組)。以上研究同國內外多個相關研究結論是一致的，即DN患者尿液miR-192表達在一定程度上反映DN的病理進展。然而，也有與上述研究相反的結論。如KRUPA等[4]報道在DN患者腎小管上皮細胞中miR-192表達明顯下降，且這種低表達與低腎小球濾過率和腎小管間質纖維化相關。造成DN相關miR-192研究結果不一致的原因目前尚不清楚，尚待進一步研究論證。本實驗中相關分析結果顯示DN患者尿液miR-192水平與SCr、BUN、24 h尿蛋白和胱抑素C呈正相關。而SCr、BUN、24 h尿蛋白和胱抑素C均是目前公認的反映腎小球濾過率變化的指標。此外，本研究應用線性回歸分析建立了基于DN臨床指標間的綜合診斷預測模型，結果進一步提示尿液miR-192水平與DN具有相關性，是T2DM患者發生DN的獨立預測因子。即T2DM患者尿液miR-192水平值越高，發生DN的可能性也越大。

目前臨床上常用的反映DN患者腎功能損傷的指標尚存在不足。如SCr、內生肌酐清除率、BUN和24 h尿蛋白對于診斷DN，尤其是早期DN的特異性有局限性，且受較多腎外因素影響[13]。而miR-192以往和本研究中表現出現的腎臟組織特異性，與目前常用的DN尿液生物學標記物存在密切的相關性，以及DN的獨立預測能力。表明尿液miR-192有潛力成為DN的早期檢測診斷標志物，有望為DN提供更敏感和可靠的指標。尤為值得關注的是，有研究通過特異性抑制腎臟細胞中miR-192的表達能夠緩解腎臟纖維化，改善蛋白尿水平。這也為未來靶向治療DN提供了新的思路和手段。