電針對大鼠失神經腓腸肌中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白/70KD核糖體蛋白S6激酶信號通路的影響①

吳夢佳，唐成林，黃思琴，安薈羽，譚程方，邱麗，朱正威，楊之雪

1.重慶醫科大學中醫藥學院，重慶市400016；2.中醫藥防治代謝性疾病重慶市重點實驗室，重慶市400016通訊作者：唐成林。E-mail：cytcl996@163.com

失神經骨骼肌萎縮是指由于失去神經的支配和營養作用，導致骨骼肌出現肌肉質量和容積不斷流失、內分泌及運動功能障礙的一種持續性病理狀態，嚴重影響患者正常生活[1]。若治療不及時，靶肌肉失去活性，將發生不可逆的失神經性肌萎縮[2]。肌蛋白的合成代謝小于降解代謝是骨骼肌質量減少和發生骨骼肌萎縮的主要原因之一[3]。治療骨骼肌萎縮，或通過抑制肌蛋白降解，或促進肌蛋白合成。本課題組前期研究發現[4-5]，電針能通過上調磷脂酰肌醇3-激酶/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路，促進萎縮骨骼肌中肌衛星細胞增殖；并通過下調萎縮骨骼肌中叉頭蛋白轉錄因子3A和肌萎縮F-box蛋白的表達，抑制骨骼肌蛋白降解，延緩失神經肌萎縮。

本研究觀察電針對萎縮腓腸肌中mTOR、磷酸化mTOR(p-mTOR,Ser2448)、70KD核糖體蛋白S6激酶(70-KD ribosomal protein S6 kinase,p70S6K)和磷酸化p70S6K(p-p70S6K,Thr389)蛋白表達的影響，從mTOR/p70S6K蛋白合成信號通路的角度，探討電針延緩失神經骨骼肌萎縮的相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級健康雄性Sprague-Dawley大鼠18只，鼠齡8周，體質量270～290 g，購于重慶醫科大學動物實驗中心，動物生產許可證號SCXK渝2012-0002，代養于SPF級動物房。

大鼠適應性喂養1周后，將大鼠編號1～18，計算機生成18個兩位隨機數字，分別對應1個編號；將隨機數從小到大排列，序號1～6為假手術組，7～12為模型組，13～18為電針組。

實驗過程中動物處置嚴格按照重慶醫科大學倫理委員會規定進行。

1.2 主要試劑與儀器

mTOR、p70S6K一抗：美國R&D SYSTEMS公司。p-mTOR、p-p70S6K一抗：美國AFFINITY BIOSCIENCES公司。Trizol總RNA提取試劑盒，RR037A逆轉錄試劑盒，SYBR Premix Ex Taq TMII，mTOR、p70S6K引物合成：日本TAKARA公司。

漢醫牌無菌針灸針：北京漢醫醫療器械中心。SDZ-II型電子針治療儀：蘇州醫療用品有限公司。柔軟型實驗大鼠固定器：溫州原上草醫療科技有限公司。AL204型電子天平：瑞士METTLER TOLEDO公司。低溫高速離心機：美國SIGMA公司。實驗室純水系統：上海和泰儀器有限公司。電泳儀：成都百樂科技有限公司。Thermo ND 2000超微量核酸蛋白測定儀、Odyssey FC成像系統：上海GENE公司。T100TMPCR儀、CFX PCR檢測系統：美國BIO-RAD公司。CellSens Standard圖像采集軟件、BX53普通正置顯微鏡：日本OLYMPUS公司。

1.3 造模方法

制備鉗夾大鼠坐骨神經腓腸肌萎縮模型[6]。模型組和電針組大鼠4%水合氯醛8 ml/kg腹腔注射麻醉，俯臥固定于手術臺上，右后肢手術區消毒，常規備皮；于坐骨結節下緣斜向切口6～8 mm，沿肌肉紋理走向鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經；取16 cm長持針器鉗夾坐骨神經中段，全齒共鉗夾3次，每次鉗夾持續10 s，間隔10 s，造成寬3.0 mm急性神經損傷，肉眼可見神經軸索透明，但外膜完整。縫合切口，碘伏消毒，復溫促醒。

假手術組只暴露神經，不行坐骨神經鉗夾術。

1.4 電針干預

造模后第2天，電針組用大鼠固定器[7]固定，根據《實驗針灸學》方法[8]，選右足三里、環跳，針灸針直刺5～7 mm，接電針儀，連續波，1.0 mA，2 Hz，刺激10 min，見大鼠下肢輕微震動。每天1次，連續干預2周。

假手術組和模型組每天相同時間同法固定，但不行電針干預。

1.5 標本采集

干預2周后，各組4%水合氯醛8 ml/kg腹腔注射麻醉，手術完整剝離雙側腓腸肌，吸干表面殘血。腓腸肌組織均分2份，一份固定于4%多聚甲醛中，用于形態學檢測；一份保存于-80℃冰箱待測。

1.6 檢測方法

1.6.1 濕重比

手術完整剝離雙側腓腸肌，清除多余肌腱及血管，電子天平稱取肌濕重，記錄雙側濕重，計算患/健側濕重比。

1.6.2 腓腸肌纖維橫截面積和直徑

取出經4%多聚甲醛固定的腓腸肌，沖洗，酒精梯度脫水，二甲苯透明45 min，浸蠟并包埋，制備石蠟切片，厚4 μm，烘干。烤片、脫蠟，蘇木素染色2 min，沖洗2 min；伊紅染色1 min，沖洗，鏡下觀察染色情況。封片，晾干。400倍光學顯微鏡下觀察組織切片，每張切片隨機選取4個視野拍照，Image-Pro Plu 6.0圖像分析軟件計算腓腸肌纖維的橫截面積和直徑。

1.6.3 Western blotting

取-80℃冰箱保存的待測組織50 mg，提取蛋白，調勻濃度，配置12%凝膠，室溫待凝15 min，60 V預電泳20 min，120 V上樣電泳100 min，300 mA轉膜90 min，室溫搖床封閉2 h。加mTOR(1∶1000)、p70S6K(1∶1000)、p-mTOR(1∶1000)、p-p70S6K(1∶1000)一抗4℃冰箱過夜，二抗(1∶1000)室溫搖床孵育1 h，TBST清洗3次，每次15 min，化學發光2 min，以GAPDH為內參，Odyssey FC成像系統成像分析計算條帶相對灰度值。1.6.4實時定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)

取-80℃冰箱待測組織50 mg，Trizol液提取總RNA，加入異丙醇沉淀10 min，12,000 r/min離心15 min，75%酒精清洗，自然晾干；加入無酶水，彈勻。充分清洗超微量核酸蛋白測定儀探頭5次，記錄總RNA純度和污染值，按比例稀釋。使用SYBR Green配制反應體系，合成反應體系，彈勻，離心后行逆轉錄：37℃15 min，85℃5 s，4℃+∞。96孔板加樣，標板，上機行qPCR反應：90℃30 s，95℃5 s，60℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 1 min，共40個循環。使用CFX Manager 3.1軟件讀取Ct值。

上下游引物序列如下。

mTOR：上游5'-AAT GGG CAC GAG TTT GTT TTC C-3'；下游5'-CGA GTT GGT GGA CAG AGG AAT G-3'。

p70S6K：上游5'-CAG CCC CGA TGA CTC AAC TCT C-3'；下游5'-GCG TTC GTG GGC TAC CAA TAA-3'。

β-actin：上游 5'-ACG GTC AGG TCA TCA CTA TCG-3'；下游5'-GGC ATA GAG GTC TTT ACG GAT G-3'。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 肌濕重比

與假手術組相比，模型組腓腸肌濕重比顯著降低(P＜0.001)，電針組明顯高于模型組(P＜0.01)。見表1。

2.2 形態學

假手術組右側肌纖維呈規則多邊形，無細胞核內移及外泄情況，形態飽滿正常。模型組肌纖維邊緣不規則，細胞核內移或外泄，肌纖維縮小。電針組較模型組肌纖維邊緣規則，細胞核內移和外泄減少。見圖1。

與假手術組相比，模型組右側腓腸肌纖維橫截面積和直徑顯著降低(P＜0.001)，電針組顯著高于模型組(P＜0.001)。見表1。

圖1 各組大鼠右側腓腸肌纖維病理學改變(HE染色，bar=50 μm)

表1 各組腓腸肌萎縮指標比較

2.3 Western blotting

與假手術組相比，模型組右側腓腸肌mTOR、p-mTOR、p70S6K和p-p70S6K蛋白表達明顯升高(P＜0.01)；電針組高于模型組(P＜0.05)。見圖2、表2。

2.4 qPCR

與假手術組相比，模型組右側腓腸肌mTOR、p70S6K基因表達升高(P＜0.05)；電針組高于模型組(P＜0.05)。見表3。

表3 大鼠腓腸肌中相關基因表達比較(2-△△Ct)

圖2 各組大鼠腓腸肌Western blotting

3 討論

失神經性骨骼肌萎縮導致的肢體痿軟、酸困無力屬中醫學“痿癥”范疇[9]。《靈樞·根結》認為：“痿疾者，取之陽明。”足三里、環跳為治療下肢癱瘓、肌肉痿痹的要穴。研究表明，電針足三里和環跳能誘導腓腸肌出現適應性肥大，促進肌衛星細胞分化，提高骨骼肌運動耐力[10]；并通過抑制過度激活的自噬水平，延緩失神經骨骼肌萎縮[11]。

肌蛋白合成代謝的正常對維持骨骼肌質量的穩定十分重要[12]。mTOR/p70S6K信號通路是促進蛋白質合成的主要通路[13]。mTOR/p70S6K通路抑制，不利于肌細胞的分化和肌管的肥大[14]；激活此通路將對肌肉生長起促進作用[15]。

mTOR是維持肌肉穩態、促進肌肉再生的關鍵因子[16]，也是參與調節mRNA翻譯的主要信號轉導樞紐[17]，p-mTOR是其持續活化的標志。電針能上調衰老骨骼肌中mTOR和p-mTOR表達，促進蛋白合成，延緩衰老性骨骼肌萎縮[18]。

mTOR激活下游效應分子p70S6K、真核細胞翻譯啟動因子4E結合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1,4EBP1)和真核細胞翻譯啟動因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E,eIf4E)[19]。在促進蛋白質合成的過程中，p70S6K與mTOR的協同性更好[20]。p70S6K被p-mTOR激活，繼而發生磷酸化，啟動蛋白翻譯過程[21]，協調細胞增殖分化。對8月齡增齡性大鼠連續預防性電針干預6個月，能上調mTOR和p70S6K表達，促進肌蛋白翻譯與合成，從而減緩增齡性大鼠骨骼肌萎縮[22]。

在重新接受神經支配的過程中，維持骨骼肌質量的穩定和活性，延緩其萎縮速度，是保持骨骼肌功能正常的關鍵。本研究表明，失神經肌萎縮2周后，大鼠腓腸肌中mTOR、p-mTOR、p70S6K、p-p70S6K的表達升高，提示腓腸肌啟動自我修復；而電針能進一步上調mTOR/p70S6K信號通路相關蛋白表達并刺激其活化，促進肌蛋白翻譯與合成，延緩腓腸肌質量下降。

綜上所述，失神經骨骼肌萎縮后，電針能上調骨骼肌中mTOR、p70S6K蛋白及基因表達，進一步調控其磷酸化水平，激活mTOR/p70S6K信號通路，促進肌蛋白翻譯與合成，維持骨骼肌質量和容積，達到延緩失神經骨骼肌萎縮的目的。