雙特異性磷酸酶2對胃癌細胞增殖凋亡的影響及機制研究

劉師偉，李輝，張奇雪，蔣昭，趙秀娟，吳云丹

胃癌作為世界上第五大常見癌癥，其在惡性腫瘤導致的死亡中占第三位［1］。盡管聯合手術、放療和化療多種治療手段，目前胃癌患者的預后仍然很差，5年的總體生存率小于25%［2］。目前對于各種腫瘤包括胃癌的精準治療十分熱門，理解其發生發展的分子機制并依此尋找安全高效的基因治療方法變得日趨緊迫。

雙特異性磷酸酶（DUSP）屬于酪氨酸特異性磷酸酶家族的經典成員，其功能除涉及生物體內多種基本的生理活動，如增殖調控、信號轉導等，也與腫瘤的發生發展密切相關［3］。目前已發現經典及非經典的DUSP成員達30余種，其中DUSP2（又稱PAC-1）已被證實不僅是免疫反應的重要調節者［4］，而且在多種腫瘤，如前列腺癌、肺癌、膠質瘤及白血病等中呈低表達，并且通過多種信號通路參與調控腫瘤的發生發展［5］。有文獻報道，DUSP2在體外可負向調控細胞外調節蛋白激酶（ERK）和P38的活性［6］，但DUSP2在胃癌中的作用及機制目前尚未明確。為此，本實驗構建了DUSP2過表達的慢病毒載體，并進一步篩選鑒定DUSP2穩定過表達的MKN-45胃癌細胞株，進而探討上調的DUSP2對胃癌細胞增殖和凋亡的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人源腎上皮細胞系293T細胞、胃癌細胞系（MKN-45、SGC-7901、HGC-27、N-87）及正常的胃上皮細胞系GES-1（江陰康眾康民生物醫藥技術有限公司）；Trans-5a感受態細胞（北京全式金生物技術有限公司）；pLVX-EF1a-IRES-puro載體、psPAX2、pMD2.G包裝質粒（上海滬震生物有限公司）；Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司）；RPMI-1640、DMEM培養液、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、雙抗（美國Hyclone公司）；嘌呤霉素（Puromycin）（美國Sigma公司）；RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒、Fast DigestXbalⅠ、NotⅠ內切酶（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Fast SYBR Green Master Mix（德國Roche公司）；無內毒素高純質粒中量提取試劑盒（離心柱型）（美國Biomiga公司）；RIPA裂解液（北京索萊寶科技有限公司）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；FLAG、ERK、p-ERK（Thr202/Tyr204）、P38、p-P38蛋白抗體（美國CST公司）；羊抗兔、兔抗鼠二抗、ECL化學發光試劑盒（美國Millipore公司）。CO2培養箱購自Thermo Fisher Scientific公司；電泳槽、電泳儀購自Bio-Rad公司。引物合成及測序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 胃癌患者預后價值評估 首先，通過公共的在線分析工具KM plotter（http://kmplot.com）評估DUSP2的表達對胃癌患者的預后價值。該分析工具整合了6個提交在GEO數據庫中的胃癌患者基因芯片結果，排除缺失數據后將876例樣本納入統計范圍，依據DUSP2mRNA表達水平繪制Kaplan-Meier生存曲線，比較DUSP2表達高低患者生存率的差異。。

1.2.2 實時定量PCR檢測DUSP2mRNA表達量 胃癌細胞株MKN-45、SGC-7901、HGC-27、N-87及正常的胃上皮細胞系GES-1均為貼壁生長，采用RPMI-1640完全培養基（10%FBS+1%雙抗）置于37℃、5%CO2培養箱飽和濕度下培養。取對數生長期的5種細胞，采用Trizol法抽提總RNA，按逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄反應獲取cDNA。逆轉錄反應體系為20 μL，反應條件為：42℃60 min；95℃5 min；4℃5 min。以上述5種細胞的cDNA為模板，通過實時定量PCR分別檢測管家基因β-actin（內參）和DUSP2mRNA的表達水平。反應體系為20 μL，反應條件：95℃10 min；95℃15 s，60℃1 min，40個循環。引物序列：DUSP2引物上游5′-TGCCCCAACCACTTTGAGG-3′；下游5′-AGTCAATGAAGC CTATGGCCT-3′；β-actin引物上游5′-ATTGCCGACAGGAT GCAGA-3′；下游5′-GAGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3′。最后采用2-ΔΔCt相對定量法進行分析。

1.2.3 重組真核慢病毒表達質粒pLVX-DUSP2-FLAG的構建 （1）DUSP2-FLAG融合片段的擴增：以pCDNA3.1-DUSP2-FLAG質粒為模板，PCR擴增DUSP2-FLAG融合基因片段。（2）pLVX載體線性化：使用快速限制性內切酶XbalⅠ、NotⅠ線性化pLVX-EF1a-IRES-puro質粒載體，同時切膠回收雙酶切PCR產物。（3）DUSP2-FLAG PCR產物與pLVXEF1a-IRES-puro線性載體連接：pLVX-EF1a-IRES-puro載體和PCR產物連接比例為1∶3，16℃反應過夜。（4）重組質粒轉化：轉化Trans-5a感受態細胞，挑取單克隆搖菌，使用去內毒素質粒小提試劑盒提取質粒，將提取的pLVX-DUSP2-FLAG質粒用Fast DigestXbalⅠ、NotⅠ雙酶切，并用1%瓊脂糖凝膠電泳進行初步鑒定，然后進行測序驗證。

1.2.4 DUSP2過表達穩定轉染細胞株的構建 用脂質體Lipofectamine 2000包裹慢病毒三質粒系統（pLVX-DUSP2-FLAG/pLVX control、pMD2.G、psPAX2）共轉染293T細胞進行病毒包裝；48～72 h后大量病毒產生，收集含病毒的培養液，經0.45 μm濾器過濾。將含有pLVX-DUSP2-FLAG和pLVX control的病毒液分別加入已預先鋪好MKN-45細胞的6孔板內，48 h后換液，加入含嘌呤霉素的培養液進行篩選（2 mg/L），培養36 h，觀察細胞狀態，逐漸降低藥物濃度，最終維持在1 mg/L。選取穩轉的細胞系進行后續實驗，細胞分組：實驗組為DUSP2穩定過表達的胃癌MKN-45細胞，對照組為空載慢病毒轉染并篩選后的胃癌MKN-45細胞。

1.3 MTS細胞增殖實驗 分別計數實驗組和對照組細胞數，按每孔500個細胞接種于96孔板，分別培養24、48、72、96 h后，向培養板中每孔加入20 μL MTS試劑，5%CO2、37℃孵箱中靜置1 h后使用Biotek酶標儀檢測各樣本490 nm處的光密度（OD）值，每個樣品重復3次。

1.4 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡 實驗組和對照組分別取3×105個細胞，加入500 μL Binding Buffer懸浮，然后各加5 μL Annexin V-FITC和5 μL Propidium Iodide混勻；室溫避光15 min后上機檢測：Q1區呈AnnexinⅤ-FITC陽性、PI陰性，為早期凋亡細胞；Q2區呈AnnexinⅤ-FITC陽性、PI陽性，為晚期凋亡細胞；Q3區呈AnnexinⅤ-FITC陰性、PI陽性，為機械性損傷細胞；Q4區呈AnnexinⅤ-FITC陰性、PI陰性，為活細胞。每組樣品重復3次，取均值進行統計分析。

1.5 實時定量PCR檢測DUSP2mRNA表達量 采用Trizol法抽提實驗組和對照組細胞總RNA，逆轉錄為cDNA后進行PCR反應，具體步驟及結果分析同1.2.2。

1.6 蛋白質印跡法（Western blot）檢測目的蛋白表達量 提取實驗組和對照組細胞總蛋白，用BCA法測定總蛋白濃度。取35～40 μg總蛋白進行10%SDS-PAGE，轉膜，封閉；加入一抗孵育過夜（按體積比1∶1 000稀釋）；洗滌后加入二抗，孵育2 h（按體積比1∶5 000稀釋）；充分洗滌后用電化學發光法曝光檢測標本膜上的信號，記錄實驗結果。

1.7 統計學方法 采用SPSS 16.0軟件進行數據統計，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間均數比較采用方差分析，組間多重比較采用Dunnett-t法，兩個樣本的組間比較采用獨立樣本的t檢驗，2組患者生存率比較采用Log-rank檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DUSP2表達與胃癌患者預后分析Kaplan–Meier分析表明DUSP2高表達的胃癌患者的生存率明顯優于低表達患者（P＜0.05），見圖1。

2.2 實時定量PCR檢測DUSP2mRNA表達量 結果表明，DUSP2mRNA表達在對照及多種胃癌細胞中的差異有統計學意義（P＜0.01），見圖2。

2.3 DUSP2過表達慢病毒載體的鑒定及穩定轉染胃癌細胞系的建立pLVX-DUSP2-FLAG質粒依次經菌落篩選、陽性菌落擴增、提取質粒、XbalⅠ、NotⅠ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測質粒的完整性和排除重組，鑒定結果與預期相符。最后進行DNA測序，測序結果與GenBank中人DUSP2基因序列完全相符。Western blot檢測FLAG的表達，結果顯示實驗組胃癌MKN-45細胞中可檢測到FLAG蛋白表達（圖3A），同時，實驗組的DUSP2mRNA水平較對照組明顯增高（n=3，t=19.365，P＜0.01），見圖3B。證實實驗組DUSP2過表達穩定轉染細胞系的構建成功。

Fig.1 Kaplan-Meier survival curves of gastric cancer patients with different expression levels of DUSP2圖1 DUSP2不同表達水平胃癌患者的生存曲線

Fig.2 The expressions of DUSP2 in gastric cancer cell lines圖2 DUSP2在不同胃癌細胞中的表達

Fig.3 The validation of DUSP2 overexpression stable cell line圖3 DUSP2過表達穩定株的鑒定

2.4 DUSP2過表達抑制胃癌MKN-45細胞的增殖并促進凋亡MTS實驗結果顯示，與對照組相比，實驗組細胞分別在24、48、72和96 h增殖能力均受到明顯抑制（均P＜0.05），見圖4。進一步用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測發現，實驗組細胞凋亡率明顯高于對照組細胞（n=3，t=4.325，P＜0.05），見圖5。

Fig.4 The effect of DUSP2 overexpression on MKN-45 cell proliferation圖4 DUSP2過表達對MKN-45細胞增殖的影響

Fig.5 The effect of DUSP2 overexpression on MKN-45 cell apoptosis圖5 DUSP2過表達對MKN-45細胞凋亡的影響

2.5 DUSP2過表達抑制ERK、P38磷酸化Western blot結果顯示，分別以總ERK、P38表達水平為對照，實驗組ERK、P38的磷酸化水平較對照組均顯著降低（n=3，t分別為16.393、7.936，P＜0.01），見圖6。

Fig.6 The effect of DUSP2 overexpression on phosphorylation of MAPK pathway圖6 DUSP2過表達對MAPK通路磷酸化水平的影響

3 討論

3.1 胃癌的臨床治療現狀 胃癌的治療主要以手術治療為主，其他綜合治療為輔。進展期胃癌患者約68%發生淋巴結轉移，常規治療后5年生存率約為30%左右［7-8］。早期胃癌患者通過外科手術治療效果相對理想，其5年生存率可以達到85%～95%［9］。但早期胃癌無明顯癥狀，大部分發現者已處于胃癌晚期，治愈較為困難。目前胃癌的傳統治療已不能滿足臨床患者的需求，亟需探索開發新的治療方法。近十年來關于腫瘤基因療法的研究已逐漸深入，研究胃癌不同發展階段的基因表達變化，可更好地幫助人們從分子層面了解胃癌的發病機制，進而為胃癌基因診斷和治療提供重要的理論依據。

3.2DUSP2基因的研究意義DUSP2又名PAC-1，是一種調控細胞增殖及凋亡的核特異性磷酸酶，其通過去磷酸化底物中絲氨酸或者蘇氨酸殘基從而使其失活［10］。最初研究發現其廣泛表達于淋巴組織，參與免疫調節等生理過程［11］。近年來研究發現，DUSP2與多種腫瘤的發生發展密切相關。如在卵巢癌中，DUSP2高表達預示了更低的總體生存率［12］。而在急性白血病患者中，DUSP2的損失和持續的ERK激活密切相關，表明DUSP2可能起著抑癌基因的角色［13］。關于DUSP2在胃癌中的作用及相關分子機制目前鮮見相關報道。本研究結果表明，胃癌患者中DUSP2低表達預示生存率較差。在胃癌細胞中，通過MTS細胞增殖及凋亡實驗發現，DUSP2的過表達使胃癌細胞的增殖能力顯著下降，而相對應的凋亡率增加，說明DUSP2表達上調可有效抑制胃癌細胞的增殖。此外，Western blot結果表明，實驗組的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路的重要介導者ERK和P38的磷酸化水平降低，說明DUSP2通過調控MAPK通路來發揮作用。上述結果驗證了DUSP2基因很可能作為抑癌基因之一，在胃癌的增殖、分化、侵襲過程中起到關鍵性的作用。

3.3 MAPK家族與腫瘤 眾所周知，MAPK是一類經典的廣泛調控細胞增殖、分化、代謝、凋亡等一系列生理過程的激酶家族的統稱［14］。哺乳動物MAPK家族主要分3類：ERK、P38絲裂原活化蛋白激酶和C-Jun N末端激酶（JNK）［15］。目前，關于ERK信號通路在腫瘤中的作用主要體現在促細胞增殖方面，而JNK和P38除了參與促進腫瘤細胞的增殖，還介導細胞的凋亡［16］。研究表明，在胃癌發生、浸潤和轉移的過程中，ERK信號通路常被激活，而且P38通路的激活也與胃癌的形成有關［17］。DUSP2作為MAPK磷酸酶家族的重要一員，是公認的MAPK家族的主要負性調控者。本研究中，DUSP2的上調表達使胃癌細胞中ERK和P38的磷酸化水平明顯降低，具體的調控機制仍需深入研究。

綜上所述，DUSP2在胃癌的發生發展中發揮重要的作用，該基因可能作為胃癌的抑癌基因和預后基因，為胃癌的臨床診斷和治療提供指導。