補(bǔ)腎柔肝方對肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1-Smads信號通路的干預(yù)作用

鄭亞江，吳 櫻，洪蔚蔚，祝峻峰

(上海市中醫(yī)醫(yī)院,上海 200071)

在各種致病因素長期、反復(fù)刺激下，肝細(xì)胞變性壞死，肝內(nèi)血管扭曲變形，大量結(jié)締組織增生，膠原纖維伸入肝小葉中形成纖維間隔并重新分隔，即為假小葉，正常肝組織遭到破壞，從而最終進(jìn)展到肝硬化[1-2]。而作為一種組織病理學(xué)概念，肝纖維化是肝硬化進(jìn)展過程中的重要環(huán)節(jié)。筆者前期研究證實，中藥復(fù)方補(bǔ)腎柔肝方對各種病因引起的肝纖維化安全、有效[3]。本實驗旨在通過觀察肝纖維化大鼠TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ以及Smad2、Smad3表達(dá)情況，探討補(bǔ)腎柔肝方對TGF-β1-Smads信號途徑的影響，明確其作用機(jī)制。

1 實驗資料

1.1動物 清潔級Wistar雄性大鼠53只，體質(zhì)量180～200 g，購自西普爾-必凱實驗動物有限公司，合格證書：SCXK(滬)2008-0016，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心提供。

1.2藥物和試劑 補(bǔ)腎柔肝方(由淫羊藿、丹參、鱉甲、黃芪、苦參等組成)制成流浸膏(3.5 g/mL)備用；秋水仙堿由云南植物藥業(yè)有限公司提供(編號01420249708)；TβRⅠ、TβRⅡ均來自Santa Cruz Biotechnology，Inc，USA，批號分別為sc-399、400；PT-RCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒，F(xiàn)ermentas公司RevertAidTMFrist Strand cDNASyntheisis Kit，K1622。

1.3儀器 臺式離心機(jī)(microfuge lite)，Beckman公司；HW-8B型旋渦混合器，江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海市躍進(jìn)農(nóng)場醫(yī)療器械廠；冷凍高速離心機(jī)，Varifuge 20RS，Heraeus公司；LEICA EG1160 石蠟包埋機(jī)；紫外可見光分光光度計UV2102 C型，Unico公司。

1.4模型制備 隨機(jī)將大鼠分成空白組8只、模型組15只、補(bǔ)腎柔肝方組15只、秋水仙堿組15只。空白組大鼠首次在背部皮下注射生理鹽水5 mL/kg，以后注射花生油3 mL/kg，其余各組大鼠首次均注射等體積的純四氯化碳，3 d后注射40%四氯化碳-花生油3 mL/kg，每周造模2次，連續(xù)8周。第9周開始，補(bǔ)腎柔肝方組、秋水仙堿組分別給予補(bǔ)腎柔肝方流浸膏5 mL/(kg·d)、秋水仙堿水溶液5 mL/(kg·d)灌胃，而空白組、模型組分別給予等體積生理鹽水灌胃，共8周，實驗期間所有大鼠均標(biāo)準(zhǔn)飲食。實驗結(jié)束后，模型組存活11只，補(bǔ)腎柔肝方組和秋水仙堿組各存活14只。

1.5樣本采集 最后一次灌胃后，禁食24 h，在無菌、無熱源條件下，乙醚麻醉大鼠，從大鼠腹主動脈采血，注入用肝素115×104IU/L處理的無熱源玻璃試管中，4 ℃離心，將分離血漿放入試管中封口，-80 ℃保存。所采肝組織標(biāo)本都必須確保取自每只大鼠的相同部位，用甲醛固定；其余肝組織-80 ℃低溫保存，用以免疫組化以及病理檢測。

1.6檢測指標(biāo)

1.6.1肝組織TβRⅠ、TβRⅡ蛋白和Smad2、Smad3水平 取-80 ℃的肝組織，約80 mg/kg，置于玻璃研磨器中，裂解、提取組織蛋白液，BCA法定量，然后經(jīng)電泳，半干轉(zhuǎn)膜、封閉，分別與Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad 3、TβRⅠ、TβRⅡ一抗(1∶600)4 ℃過夜，最后加入用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000)，經(jīng)過化學(xué)發(fā)光、顯影、壓片、灰度掃描后，根據(jù)實驗組目的蛋白灰度值與模型組目的蛋白灰度值的比值來表示蛋白表達(dá)水平。

1.6.2肝組織中TβRⅠ、TβRⅡmRNA表達(dá)水平采用RT-PCR法檢測。TRIzol試劑法提取肝組織中總RNA，然后按照試劑盒說明書進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。取上述反應(yīng)產(chǎn)物6 μL置于瓊脂糖凝膠電泳，用DNA Maker(DL2000)作為標(biāo)記，通過紫外透射儀觀察，最后拍照，輸入電腦，目的電泳條帶采用BIO-PROFIF凝膠圖像系統(tǒng)(法國VL公司提供)分析，參照物為對應(yīng)的內(nèi)參(GAPDH)電泳條帶，分別計算兩者的積分吸光度，結(jié)果以兩者的比值表示。

1.6.3肝組織中TGF-β1mRNA表達(dá)水平 采用RT-PCR法檢測。TRIzol法提取肝組織中總RNA。大鼠TGF-β1、β-action引物來源于bioinformatics軟件。按照試劑盒說明書操作，最后取反應(yīng)產(chǎn)物15 μL置于2.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，采用Band Leader軟件分析灰度的信號半定量值，并以各組目的條帶灰度值與模型組目的條帶灰度值比值表達(dá)各相應(yīng)mRNA水平。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠肝組織中TβRⅠ、TβRⅡ蛋白表達(dá)水平比較 與空白組比較，模型組TβRⅠ、TβRⅡ蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P均<0.05)；與模型組比較，補(bǔ)腎柔肝方組及秋水仙堿組TβRⅠ、TβRⅡ蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P均<0.05)。見表1及圖1。

表1 各組大鼠肝組織中TβRⅠ、TβRⅡ蛋白表達(dá)水平比較

注：①與空白組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

圖1 各組大鼠肝組織中TβRⅠ、TβRⅡ蛋白表達(dá)情況

2.2各組大鼠肝組織中Smad2、Smad3磷酸化水平比較 各組間Smad2和Smad3磷酸化水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見圖2。

1為空白組；2為模型組；3為秋水仙堿組；4為補(bǔ)腎柔肝方組圖2 各組大鼠肝組織中Smad2、Smad3蛋白表達(dá)情況

2.3各組大鼠肝組織中TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ mRNA表達(dá)水平比較 與空白組比較，模型組TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡmRNA表達(dá)水平均明顯升高(P均<0.05)；與模型組比較，補(bǔ)腎柔肝方組及秋水仙堿組TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ mRNA表達(dá)水平均明顯降低(P均<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠肝組織中TGF-β1、TβRⅠ、 TβRⅡ mRNA表達(dá)水平比較

注：①與空白組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

3 討 論

肝臟在各種致病因素長期刺激下發(fā)生慢性炎癥、壞死、增生，逐漸進(jìn)展到肝硬化、肝癌，肝纖維化作為一種自身修復(fù)反應(yīng)，是這個發(fā)展過程中的必經(jīng)之路。而通過積極、及時的治療，肝纖維化多數(shù)可以逆轉(zhuǎn)，因此引起廣大研究者的關(guān)注，成為近年來肝病領(lǐng)域的研究熱點。但從目前的臨床現(xiàn)狀來看，還沒有尋找到一個臨床療效確切、無毒副作用、可以廣泛推廣使用的治療肝纖維化的有效方案或者藥物，這也是目前臨床急需解決的問題。

祖國醫(yī)學(xué)中并沒有“肝纖維化”的名稱，多將其歸于“癥瘕”“積聚”“臌脹”“黃疸”“脅痛”等范圍。其病因病機(jī)為外感濕熱疫毒，內(nèi)蘊(yùn)中焦，熏蒸肝膽；或飲食不節(jié)，恣食肥甘厚味，脾胃運化功能失常，濕濁內(nèi)生，日久化熱，煉液為痰，氣機(jī)升降逆亂，血液運行阻滯，痰熱、瘀血互結(jié)。因濕邪黏膩重濁，纏綿難愈，易耗傷正氣，形成濕熱、疫毒、痰瘀、正虛交結(jié)的復(fù)雜病理局面。病機(jī)特點為本虛標(biāo)實，虛實夾雜。其病位在肝脾，久病及腎，最終肝、脾、腎三臟俱損。故中醫(yī)治療多從肝、脾、腎三臟入手，治以扶正補(bǔ)虛、活血化瘀。 長期臨床實踐表明，中藥復(fù)方具有多靶點的作用，可以顯著抑制、甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化，比較適合肝纖維化復(fù)雜多變的病情[4]。

在長期的臨床工作中，名老中醫(yī)王靈臺教授認(rèn)為肝纖維化病機(jī)主要為脾腎虧虛，瘀血阻絡(luò)，并通過大量臨床驗證總結(jié)出安全、有效的中藥復(fù)方補(bǔ)腎柔肝方，全方補(bǔ)腎益脾但不滋膩滯氣，清熱解毒但不傷陰劫液，活血化瘀但不耗血動血，具有補(bǔ)腎填精、健脾益氣、軟堅散結(jié)、清肝利膽的作用，扶正祛邪，標(biāo)本兼治[5-6]。

TGF-β1是強(qiáng)有力的促進(jìn)纖維化形成的細(xì)胞因子[7]。在肝纖維化過程中，TGF-β1首先干擾肝細(xì)胞DNA的合成，抑制肝實質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，激活星狀細(xì)胞，從而導(dǎo)致多種膠原成分合成增加，同時基質(zhì)金屬蛋白酶的合成、降解減少，膠原纖維沉積，最終形成肝纖維化[8]。因為在肝纖維化時，TGF-β1的表達(dá)水平與組織病理學(xué)變化相一致，所以為了明確肝纖維化的進(jìn)展程度，可以通過檢測TGF-β1的表達(dá)水平來進(jìn)行判斷[9]。而TGF-β1是通過TGF-β受體發(fā)揮生物效應(yīng)的，其受體是一個跨膜復(fù)合物，有3種亞型，與肝纖維化相關(guān)的主要是Ⅰ型和Ⅱ型。在通過整合素、基質(zhì)金屬蛋白酶、纖溶酶等作用激活TGF-β1后，胞外活化型的TGF-β1與Ⅱ型受體結(jié)合，后者其胞內(nèi)側(cè)絲氨酸羧基端產(chǎn)生自身磷酸化，從而具有激酶活性，與Ⅰ型受體結(jié)合后進(jìn)一步磷酸化其活化區(qū)域，形成一個異四聚體復(fù)合物，包括Ⅰ型和Ⅱ型受體各2個。這樣，信號就通過已被活化的Ⅰ型受體從胞外傳到胞內(nèi)，作用于目的基因。因此，信號能夠通過細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)是其發(fā)揮生物作用的關(guān)鍵[10]。

在肝纖維化相關(guān)的所有細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路中，研究最為成熟的就是TGF-β1-Smads通路。Smads蛋白是TGF-β1受體胞內(nèi)激酶的底物，決定著TGF-β1信號途徑跨膜傳導(dǎo)的成敗。TGF-β1和Smads蛋白共同調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化、合成、凋亡[11]。目前Smads家族成員分為3種類型：膜受體調(diào)節(jié)性Smad(R-Smad，包括 Smad1、Smad 2、Smad 3、Smad 5、Smad 8)、共用介質(zhì)性Smad(co-Smad：Smad4)和抑制性Smad(I-Smad：Smad6、Smad 7)。其中R-Smad與信號通路的特異性有關(guān)，是Ⅰ型受體胞內(nèi)激酶的特異性底物；co-Smad與其他Smad構(gòu)成多聚體后，可以進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)靶基因；而I-Smad則通過競爭被受體激活的R-Smads或者TGF-β1Ⅰ型受體，使之形成無活性的聚合體或喪失磷酸化，從而阻止信號途徑的進(jìn)一步轉(zhuǎn)導(dǎo)[12]。肝纖維化形成與Smads密切相關(guān)，在Smad3的參與下，活化的肝星狀細(xì)胞才能產(chǎn)生最大效應(yīng)，合成大量的膠原蛋白。而且在肝損傷的不同階段，Smads生物效應(yīng)也不同，急性肝損傷時，Smad2在TGF-β1及受體誘導(dǎo)下產(chǎn)生磷酸化，但其活性受到磷酸化的Smad7負(fù)性調(diào)節(jié)，這樣在肝星狀細(xì)胞內(nèi)，TGF-β1/Smad信號傳導(dǎo)保持平衡狀態(tài)；而在慢性肝損傷階段，因為Smad7不能被磷酸化，所以就不能抑制Smad2活化，信號傳導(dǎo)平衡狀態(tài)失衡，Smad2信號得以下傳，調(diào)控膠原蛋白基因，使之大量轉(zhuǎn)錄，慢性肝損傷過程中肝纖維化的形成可能就與這一作用機(jī)制有關(guān)[12]。

本課題研究結(jié)果顯示，模型組肝組織中TβRⅠ、TβRⅡ蛋白及TGF-β1、TβRI、TβRⅡmRNA表達(dá)水平均顯著高于空白組，補(bǔ)腎柔肝方組和秋水仙堿組TβRⅠ、TβRⅡ蛋白以及TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ mRNA表達(dá)水平均顯著低于模型組，各組間Smad2和Smad3磷酸化水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。說明補(bǔ)腎柔肝方可顯著降低肝組織中TβRⅠ、TβRⅡ表達(dá)水平，但對Smad2和Smad3磷酸化水平無明顯影響，表明在TGF-β1/Smads信號傳導(dǎo)通路中，補(bǔ)腎柔肝方主要是通過抑制TβRⅠ、TβRⅡ表達(dá)，無法磷酸化的Smad2和Smad3失去活性，從而阻斷信號通路傳導(dǎo)發(fā)揮抗纖維化的作用。