鼠婦乙酸乙酯提取物抗炎鎮痛作用研究

段哲萍,于新江,張 卉,吳大勇,李菁菁

(1. 河北省人民醫院,河北 石家莊 050051；2. 河北醫科大學，河北 石家莊 050017)

疼痛是晚期惡性腫瘤患者的常見癥狀，臨床上應用非甾體抗炎藥，曲馬多、嗎啡，羥考酮、芬太尼等三階梯止痛藥可以有效控制癌痛，但三階梯止痛藥物有劑量依賴性、成癮依賴性(指藥物與機體相互作用所造成的一種精神狀態及身體狀態，患者表現出一種強迫性連續定期用該藥的行為，目的是要去感受藥物的精神效應，或是為了避免由于斷藥所引起的不舒適)，且強阿片類藥物有嚴重的毒副作用如惡心、嘔吐、反酸、慢性胃炎、便秘、尿潴留、嗜睡、頭暈、認知能力下降、呼吸抑制、體位性低血壓等[1-4]，故尋求鎮痛效果穩定而軀體及精神依賴性小、安全性高的藥物是目前研究的熱點。近年來研究發現，鼠婦提取物具有明顯鎮痛作用，可用于各類疼痛的治療，但其機制尚不十分明確[5-7]。本研究探討了鼠婦乙酸乙酯提取物的鎮痛作用、成癮性及相關作用機制，現將結果報道如下。

1 實驗資料

1.1實驗動物及藥品 體質量20 g左右的清潔級昆明小鼠120只，雌雄各半，由河北醫科大學實驗動物中心提供，合格證號:scxk(桂)20170002。鼠婦乙酸乙酯提取物由河北中醫學院藥學院制備、鑒定、濃度測定，李愛英教授贈送。冰醋酸(北京精細化學用品有限責任公司)，嗎啡注射液(華北制藥廠，10 mg/支)，鹽酸納洛酮(北京四環醫藥股份有限公司，0.4 mg /支)，生理鹽水(北京四環醫藥股份有限公司)，環氧化物水解酶(COX)試劑盒(Cayman公司，美國)。

1.2實驗方法

1.2.1冰醋酸誘發小鼠扭體法鎮痛實驗 隨機取上述昆明小鼠40只，雌雄各半，禁食12 h后隨機分為4組，每組10只。生理鹽水組小鼠給予皮下注射生理鹽水10 mL/kg，鼠婦低、中、高劑量組小鼠分別皮下注射鼠婦乙酸乙酯提取物50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg(參考文獻[6]確定給藥劑量)，干預30 min后，每只小鼠腹腔注射1.0%冰醋酸10 mL/kg致痛，觀察記錄20 min內每只小鼠產生扭體反應的次數，并計算扭體反應抑制率。扭體反應抑制率=(對照組扭體反應次數均數-給藥組扭體反應次數均數)/給藥組扭體反應次數均數×100%。

1.2.2嗎啡刺激小鼠S形豎尾成癮性實驗 隨機取上述昆明小鼠40只，雌雄各半，禁食12 h后隨機分為嗎啡組和鼠婦低、中、高劑量組，每組10只。4組小鼠均給予皮下注射嗎啡注射液15 mg/kg(參考文獻[6]確定給藥劑量)，鼠婦低、中、高劑量組小鼠注射嗎啡后分別皮下注射鼠婦乙酸乙酯提取物50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg，均1次/d,連續注射15 d，每日給藥后15 min記錄各組小鼠S形豎尾反應情況。

1.2.3納洛酮催癮小鼠跳躍成癮性實驗 取剩余40只小鼠，禁食12 h后隨機分為嗎啡組和鼠婦低、中、高劑量組，每組10只。4組小鼠均給予皮下注射嗎啡注射液100 mg/kg(參考文獻[7]確定給藥劑量，使小鼠成癮)，鼠婦低、中、高劑量組小鼠注射嗎啡后分別皮下注射鼠婦乙酸乙酯提取物50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg，均每12 h 1次，連續7 d，注射結束后6 h，每組小鼠均給予皮下注射納洛酮注射液5 mg/kg催癮，隨即將小鼠放于圓形實驗臺上(高30 cm，直徑30 cm)，記錄30 min內每組跳躍小鼠數。

1.2.4鼠婦乙酸乙酯提取物對COX酶的抑制實驗根據COX酶試劑盒的具體實驗步驟進行操作。取96孔板，分成8組，每組3孔。每孔中均加入160 μL緩沖液、10 μL血紅素液、10 μL DMSO。設置空白對照組；陽性對照組再加入10 μL COX酶溶液；各給藥組除加入10 μL COX酶溶液外，再分別加入10 μL不同濃度的鼠婦乙酸乙酯提取物(7.5 ng/mL、15 ng/mL、30 ng/mL、60 ng/mL、120 ng/mL、240 ng/mL)；8組均加入20 μL顯色劑及20 μL酸劑，混勻，放置5 min后于酶聯免疫檢測儀590 nm處測定吸光值并記錄，計算抑制率。抑制率=[1-(給藥組吸光值均數-空白組吸光值均數)/(對照組吸光值均數-空白組吸光值均數)]×100%。

2 結 果

2.1各組冰醋酸誘發小鼠扭體反應情況 鼠婦各劑量組小鼠扭體次數均明顯少于生理鹽水組(P均<0.05)。鼠婦各劑量組的扭體反應抑制率隨鼠婦乙酸乙酯提取物劑量的增加而升高，呈現劑量依賴關系；鼠婦中劑量組的扭體反應抑制率達74.002%，為最佳試驗藥物濃度。見表1。

表1 鼠婦乙酸乙酯提取物對冰醋酸誘發小鼠扭體反應的影響

注：①與生理鹽水組比較，P<0.05。

2.2各組嗎啡刺激小鼠豎尾情況 嗎啡組小鼠注射嗎啡注射液15 min后均出現S型豎尾現象,而鼠婦各劑量組小鼠均未出現S型豎尾現象。

2.3各組納洛酮催癮小鼠跳躍情況 嗎啡組小鼠注射納洛酮注射液催癮后，在高臺上均出現跳躍現象；鼠婦各劑量組小鼠注射納洛酮注射液催癮后均未出現跳躍現象。

2.4鼠婦乙酸乙酯提取物對COX酶的抑制情況 鼠婦乙酸乙酯提取物對COX-1酶和COX-2酶均有抑制作用，且隨藥物濃度的增加抑制作用逐漸增強，其對COX-1酶的抑制作用優于對COX-2酶的作用。鼠婦乙酸乙酯提取物對COX-1酶的IC50為22.723 ng/mL，對COX-2酶的IC50為33.512 ng/mL。見圖1。

圖1 不同濃度鼠婦乙酸乙酯提取物對COX酶的抑制情況

3 討 論

鼠婦又名濕蟲、潮濕蟲、地虱等，是無脊椎動物節肢動物門甲殼綱潮蟲亞目潮蟲科鼠婦屬，味酸、性涼、無毒。鼠婦主要藥用有效成分有蛋白質、黏多糖、軟骨素、蟻酸、還原糖、多種飽和及不飽和脂肪酸等，而各種溶劑提取的藥用成分也不盡相同[8-9]。目前鼠婦常用的提取方法有蒸餾法、酸堿法、酶提取法等，常用的有機溶劑有水、葡萄糖、乙醇、乙醚、石油醚、乙酸乙酯、丙酮、氯仿等，其中鼠婦水提取物的主要成分為甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天門冬氨酸、γ-氨基丁酸、亮氨酸、異亮氨酸等多種蛋白多肽[10]；鼠婦乙酸乙酯提取物的主要成分是甾體類化合物，包括β-谷甾醇、7α-羥基膽固醇、7β-羥基膽固醇、麥角甾醇、5-烯-3β-膽固醇等[7]。本實驗觀察了鼠婦乙酸乙酯提取物的鎮痛作用、安全性，結果顯示鼠婦各組的扭體次數均明顯少于生理鹽水組，鼠婦低、中、高劑量組扭體反應抑制率分別為39.252%，74.002%，96.794%，說明鼠婦乙酸乙酯提取物具有確切的鎮痛效果，且呈劑量依賴性。2個成癮性實驗結果顯示，鼠婦各劑量組小鼠成癮反應均未引出，提示鼠婦乙酸乙酯提取物的鎮痛作用不具有成癮依賴性，說明鼠婦乙酸乙酯提取物3個劑量范圍內的實驗用藥安全可靠。

前列腺素(PG)是重要的致痛物質，而COX酶是催化花生四烯酸轉化為PG合成過程中的所需酶，也是PG合成初始過程中的關鍵限速酶。非甾體類抗炎藥就是通過抑制PG生成的COX酶途徑而發揮抗炎鎮痛作用的[11-12]。COX酶是一種雙功能酶，具有環氧化酶和過氧化氫酶活性，可以催化多種環氧化物和芳烴氧化物的水解過程[13-14]。目前發現COX酶具有2種同工酶，即COX-1酶和COX-2酶。COX-1酶為結構型，是要素酶，廣泛存在于胃、血管、腎等正常組織中，它催化生成的PG參與機體正常的生理過程，如可調節胃黏膜周圍的血流、胃黏液的分泌，從而起到保護胃黏膜的作用；可調節血小板的聚集、外周血管阻力及腎臟血流量分布，具有保護功能[15-16]。COX-2酶為誘導型，是誘導酶，即給予一定刺激后迅速產生的酶，可由多種化學、物理和生物因子損傷性刺激而誘導產生，激活的磷脂酶A2水解細胞膜磷脂，生成花生四烯酸，后者經COX-2酶催化加氧生成PG，催化PG合成參與炎癥反應的過程[17-19]。本實驗結果顯示，鼠婦乙酸乙酯提取物對COX-1酶和COX-2酶均有抑制作用，且對COX-1酶的抑制作用優于對COX-2酶的作用，并隨給藥濃度的增加抑制作用逐漸增強。表明鼠婦乙酸乙酯提取物是通過抑制COX-1酶、COX-2酶而起到鎮痛作用的。

綜上所述，鼠婦乙酸乙酯提取物對于疼痛模型小鼠具有明顯鎮痛作用，且該作用無成癮性，其是通過抑制COX酶途徑而發揮抗炎鎮痛作用的。