華蟾素增強氟尿嘧啶對食管癌TE-1細胞殺傷作用及機制研究

劉 博，戚 誠*，趙 爽，趙曉東，劉學臣，張立超，石 暢

0 引言

食管癌發病率在全球呈現上升趨勢，在消化系統惡性腫瘤中，其死亡率較高。食管癌以發現晚為特點，5年生存率極低，大部分食管癌發現時均無手術機會[1]。目前，放化療是藥物治療不能手術的食管癌的主要治療方式[2]，中藥在惡性腫瘤中的應用已經取得了極大進展，尤其中藥聯合化療藥物的應用，可以達到提高治療有效率、減少化療藥物劑量及毒副反應、延長患者生存期的目的[3-5]。華蟾素是近年應用的抗腫瘤藥物之一，在肺癌及胃癌等惡性腫瘤中有應用[6]，獲得了肯定的效果，但目前其在食管癌中的作用及機制研究缺乏客觀實驗證據。本研究采用華蟾素聯合氟尿嘧啶，觀察食管癌離體細胞增殖、凋亡及細胞周期的變化，評價華蟾素對食管癌細胞的殺滅作用及對氟尿嘧啶化療增效作用，并探討其作用機制，為臨床應用提供客觀實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人食管癌細胞株TE-1購自上海中科院細胞庫，采用含10%胎牛血清、青霉素及鏈霉素的1640培養基，在37 ℃、5%CO2培養箱進行貼壁細胞培養。0.25%胰蛋白酶進行消化傳代，取對數生長期的TE-1細胞進行實驗，所有的實驗均重復3次，以平均值進行統計。華蟾素注射液(CAS No.521-61-9)購自安徽華潤金蟾藥業股份有限公司，氟尿嘧啶注射液(CAS No. 51-21-8)購自上海旭東海普藥業有限公司。ECL發光試劑盒、DAB顯色試劑盒及BCA定量試劑盒均購自南京凱基生物公司。MTT試劑盒購自美國Biosharp公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒購自美國Millpore公司；Bcl-2單克隆抗體、Bax單克隆抗體、Cleaved PARP多克隆抗體及Survivin多克隆抗體均購自美國Santa Cruz生物技術公司。實驗細胞分為陰性對照組(Negative Control組)、華蟾素干預組(Cinobufotalin組)、華蟾素及氟尿嘧啶共同干預組(Cinobufotalin+5-FU組)及氟尿嘧啶組(5-FU組)，Negative Control組給予DMSO干預作為空白對照，Cinobufotalin+5-FU組及5-FU組氟尿嘧啶濃度均為25 μmol/L。

1.2 方法

1.2.1 Western印跡 Cinobufotalin組以0、5、50、500 μmol/L濃度梯度華蟾素作用48 h后，依照細胞蛋白提取試劑盒規定步驟進行蛋白提取，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白進行分離并電轉移至PVDF膜上。加入5%脫脂奶粉，在室溫條件下進行90 min封閉后，分別加入Bcl-2、Bax、Cleaved PARP及Survivin一抗，進行孵育過夜后加入對應二抗，再孵育后進行化學發光法顯色。應用Quantity One對灰度值進行定量分析。

1.2.2 流式細胞術檢測TE-1凋亡及細胞周期 Cinobufotalin組、Cinobufotalin+5-FU組(50 μmol/L華蟾素干預24 h)、Negative Control組及5-FU組TE-1細胞培養48 h后轉移至EP管，給予預冷及PBS洗滌后加入預冷70%乙醇，在4 ℃溫度下固定24 h。1 000 r/min 離心10 min后棄上清。對每個樣品均采用PBS重懸，加0.5% PI 40 μl、RNase A 20 μl(10 mg/ml)，4 ℃下避光溫浴35 min，上流式細胞儀進行細胞周期檢測。另取培養48 h的各組細胞，依據Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書規定步驟測定細胞凋亡，軟件Cell Quest進行凋亡率分析，計算早期凋亡陽性的細胞百分比。

1.2.3 MTT法檢測不同華蟾素濃度梯度及不同培養時間TE-1細胞存活率 各組細胞以6×104/ml數加入96孔板內培養6 h，細胞貼壁后Cinobufotalin組及Cinobufotalin+5-FU組加入0、5、10、15、20、25 μmol/L濃度梯度的華蟾素作用48 h，每個濃度均設3個復孔。48 h后在每孔內均加入5 mg/L的10% MTT液，在37 ℃溫箱孵育4 h后棄上清，加入150 μl DMSO，震蕩25 min后進行光密度值(OD值)測定，計算細胞存活率。另取細胞待貼壁后Cinobufotalin組及Cinobufotalin+5-FU組細胞加入50 μmol/L的華蟾素，分別在細胞培養24、48、72、96 h后行MTT檢測，步驟同前，測定TE-1細胞在不同時點存活率。

2 結果

2.1 華蟾素干預后凋亡相關蛋白的表達 Western blot檢測0、5、50、500 μmol/L濃度梯度華蟾素干擾前后凋亡相關蛋白變化。隨著Cinobufotalin濃度升高，Bcl-2、Survivin蛋白表達水平呈劑量依賴性下降，與0 μmol/L濃度對比，Bcl-2蛋白表達在5、50、500 μmol/L差異有統計學意義(t=6.922，P<0.01；t=7.736，P<0.01；t=11.075，P<0.01)，Survivin蛋白表達在50、500 μmol/L差異有統計學意義(t=5.248，P<0.01；t=12.663，P<0.01)；隨著Cinobufotalin濃度升高，Cleaved PARP、Bax蛋白表達呈劑量依賴性上升，與0 μmol/L 濃度對比，Cleaved PARP在5、50、500 μmol/L 差異有統計學意義(t=4.179，P<0.05；t=8.631，P<0.01；t=9.254，P<0.01)，Bax蛋白在50、500 μmol/L差異有統計學意義(t=2.169，P<0.05；t=7.428，P<0.01)，見圖1。

圖1 華蟾素干預后凋亡相關蛋白表達

2.2 華蟾素干預后TE-1細胞凋亡變化 流式細胞儀檢測顯示，Negative Control組、Cinobufotalin組、Cinobufotalin+5-FU組、5-FU組的TE-1細胞凋亡率分別為21.32%、39.63%、59.52%、45.21%，Cinobufotalin組的TE-1細胞凋亡率高于Negative組，差異有統計學意義(t=2.236，P<0.05)；Cinobufotalin+5-FU組的TE-1細胞凋亡率高于Negative Control組、Cinobufotalin組、5-FU組，差異有統計學意義(t=11.809，P<0.01；t=4.132，P<0.05；t=3.671，P<0.05)。

2.3 華蟾素干預后TE-1細胞周期變化 與Negative Control組對比，Cinobufotalin組TE-1細胞培養48 h后細胞周期停留在G1期及G2期的比例減少，在S期的比例升高，差異有統計學意義(t=2.504，P<0.05；t=2.842，P<0.05；t=3.493，P<0.05)；與Negative Control組對比，Cinobufotalin+5-FU組TE-1細胞培養48 h后細胞周期停留在G1期及G2期的比例減少，S期的比例升高，差異有統計學意義(t=9.024，P<0.01；t=8.373，P<0.01；t=7.376，P<0.01)；與Cinobufotalin組對比，Cinobufotalin+5-FU組TE-1細胞培養48 h后細胞周期停留在G1期及G2期的比例減少，S期的比例升高，差異有統計學意義(t=4.436，P<0.05；t=3.226，P<0.05；t=3.503，P<0.05)；與5-FU組對比，Cinobufotalin+5-FU組TE-1細胞培養48 h后細胞周期停留在G1期及G2期的比例減少，S期的比例升高，差異有統計學意義(t=2.163，P<0.05；t=2.965，P<0.05；t=3.672，P<0.05)，見表1。

表1 流式細胞檢測細胞周期(%)

2.4 華蟾素干預后不同培養時間TE-1細胞存活率 MTT顯示，給予 Cinobufotalin 50 μmol/L干預條件下TE-1細胞培養24、48、72、96 h后，細胞存活率呈現時間依賴性下降趨勢，與Negative Control組對比，Cinobufotalin組TE-1細胞培養48、72、96 h后存活率低，差異有統計學意義(t=3.029，P<0.05；t=3.176，P<0.05；t=3.992，P<0.05)；與Negative Control組對比，Cinobufotalin+5-FU組TE-1細胞培養48、72、96 h后存活率降低，差異有統計學意義(t=11.527，P<0.01；t=12.459，P<0.01；t=13.579，P<0.01)；與Cinobufotalin組對比，Cinobufotalin+5-FU組TE-1細胞培養48、72、96 h后存活率低，差異有統計學意義(t=8.236，P<0.01；t=7.932，P<0.01；t=9.19，P<0.01)；與5-FU組對比，Cinobufotalin+5-FU組TE-1細胞培養48、72、96 h后存活率低，差異有統計學意義(t=7.164，P<0.01；t=6.984，P<0.01；t=9.052，P<0.01)，見圖2。

圖2 MTT檢測不同培養時間華蟾素處理后細胞

2.5 不同濃度華蟾素干預后TE-1細胞存活率 不同濃度梯度(0、5、10、15、20、25 μmol/L)的華蟾素作用48 h后，Cinobufotalin組及Cinobufotalin+5-FU組TE-1細胞存活率呈現劑量依賴性下降，與0 μmol/L濃度對比，Cinobufotalin組在20 μmol/L及25 μmol/L差異有統計學意義(t=2.217，P<0.05；t=3.021，P<0.05)，Cinobufotalin+5-FU組在15、20、25 μmol/L差異有統計學意義(t=3.187，P<0.05；t=5.853，P<0.01；t=7.293，P<0.01)；與Cinobufotalin組相比，Cinobufotalin+5-FU組TE-1細胞存活率在20、25 μmol/L較低，差異有統計學意義(t=2.473，P<0.05；t=3.578，P<0.05)，見圖3。

圖3 MTT檢測不同濃度華蟾素處理后細胞存活率(培養48 h)

3 討論

大部分食管癌患者在確診時已經失去手術時機，以手術為基礎的綜合治療在2/3的患者中不能實現[7]，放療及化療是目前新輔助治療或綜合治療的主要內容，尤其對于晚期食管癌，放療及化療是減輕患者癥狀、延長患者生存期的主要治療方式[8]。化療藥不良反應大，一部分食管癌患者對化療敏感性差，且易發生耐藥。中藥治療在食管癌方面是研究的主要方向，并取得了一定進展[9]。華蟾素提取自干蟾皮，是其中的脂溶性成分。多項研究表明，在中藥中，華蟾素具有較強的抗癌療效，用于肺癌、胃癌、子宮內膜癌及肝癌等惡性腫瘤的治療，但目前對其抗癌機制的研究較少[10-12]。

本研究顯示，華蟾素干擾后，Bcl-2/Bax通路中，Bcl-2及Survivin蛋白表達水平呈劑量依賴性下降，二者表達受到抑制，Cleaved PARP及Bax蛋白表達呈劑量依賴性上升，二者表達受到激活，表明華蟾素可能通過Bcl-2/Bax信號通路發揮對惡性腫瘤細胞的作用。Bcl-2/Bax信號通路是食管癌細胞活性過程中凋亡相關通路，Bcl-2/Bax比例對食管癌細胞凋亡具有重要影響，也是食管癌預后的標志物之一[13]，二者比例降低會導致腫瘤細胞凋亡增加，細胞存活率降低，細胞增殖活性降低。Survivin及Cleaved PARP是該信號通路的下游蛋白，直接影響腫瘤細胞的增殖及凋亡等惡性行為，Survivin是重要的促癌基因，PARP裂解為Cleaved PARP會抑制腫瘤細胞的增殖活性，促進其凋亡，是重要的抑癌基因[14]。進一步細胞實驗顯示，華蟾素干擾后TE-1細胞凋亡率升高，而華蟾素聯合氟尿嘧啶TE-1細胞凋亡率進一步增高，明顯高于華蟾素或氟尿嘧啶單藥應用，細胞周期研究也顯示，華蟾素及氟尿嘧啶聯合應用后TE-1細胞留在G1期及G2期的比例減少，S期的比例升高，均強于二者單藥應用。MTT顯示，給予華蟾素干預后，TE-1細胞存活率呈現時間依賴性下降趨勢，聯合氟尿嘧啶后，細胞存活率呈現進一步下降趨勢，均較單藥應用下降明顯。隨著華蟾素濃度升高，聯合氟尿嘧啶后細胞存活率也呈現明顯下降趨勢，呈現濃度依賴性。病理標本研究顯示，華蟾素處理后，癌細胞表現為核破碎，組織壞死及變性，對腫瘤細胞具有殺滅作用。氟尿嘧啶是消化系統腫瘤最常用的化療藥物，在食管癌中也是化療的首選藥物之一，但其抗腫瘤作用有限，不良反應也較為常見，聯合中藥應用可以達到化療增效、降低毒副作用的目的。本研究顯示，華蟾素聯合氟尿嘧啶應用于食管癌細胞，在促進細胞凋亡、降低細胞生存率、抑制細胞復制等方面均優于單藥應用。

另有研究顯示，華蟾素可提高腫瘤患者細胞免疫及體液免疫水平，提高患者自體腫瘤細胞殺滅能力。隨著更多靶點的發現，靶向治療也是食管癌治療的主要研究方向，中藥聯合靶向藥物治療可能達到增強治療效果、減輕藥物毒副反應的目的。目前，化療聯合放療是術前新輔助治療、術后輔助治療及晚期食管癌治療的主要藥物治療方式，而中藥聯合化療在越來越多的腫瘤治療中心展開，并取得了重大進展，華蟾素作為近年研發的抗腫瘤作用較強的中藥之一，受到很多研究者的關注。對華蟾素中抗腫瘤單劑的進一步提取是未來的研究方向。