基于高通量測序的黃河三角洲4種人工林土壤細菌結構及多樣性研究

丁新景,黃雅麗,敬如巖,馬風云,*,安 然,田 琪,陳博杰

1 山東農業大學林學院,泰安 271018 2 中國科學院西北生態環境資源研究院 中國科學院寒旱區陸面過程與氣候變化重點實驗室,蘭州 730000 3 中國科學院大學,北京 100049

土壤微生物數量龐大,在生態系統的能量流動和物質循環等生態過程中起著重要的作用,維系著生態系統正常運轉,是維護森林生態系統發揮正常生態功能的重要組成部分[1- 2]。土壤微生物的種類組成和群落結構,在很大程度上決定著土壤的生物活性[3]。細菌作為土壤微生物重要的組成部分,具有含氮量高、含碳量低的特點,對土壤養分的形成與分解有促進作用[4- 5]。土壤中的細菌多樣性與土壤有機碳、全氮、全磷等含量關系密切,細菌對土壤環境變化敏感,能夠在較短的時間內發生大幅度變化[6- 7]。作為土壤質量的重要指標及恢復環境的先鋒,細菌提高了生態系統的緩沖能力,細菌多樣性指標已經用來評價生態系統中生物群系與恢復功能之間的聯系并能為退化土壤恢復提供有用信息[7]。

黃河三角洲地區自20世紀80年代開始大面積營建人工林,主要選用具有耐鹽堿、耐干旱特性的刺槐(Robiniapseudoacacia)、榆樹(Ulmuspumila)、絨毛白蠟(Fraxinusvelutina)、臭椿(Ailanthusaltissima)等樹種,營建的人工林具有抑鹽壓堿、防風固沙、保持水土、涵養水源、調節氣候及改良土壤等重要作用。目前針對該區人工林已經開展了多方面的研究,大多集中于土壤水鹽變化[8]、生物群落[9]、土壤養分[10]、土壤生物炭變化[11],但關于土壤細菌群落的研究報道較少。黃河三角洲刺槐、絨毛白蠟、臭椿、榆樹4種栽植面積較大,是具有代表性的人工林,本研究采用高通量測序技術研究這4種林分土壤細菌群落結構及多樣性,并分析比較黃河三角洲人工林細菌群落差異及其與土壤環境因子關系,可以更好的了解細菌在該類人工林生長中的組成結構,也可為黃河三角洲這類林分中有益菌的篩選和培育及相應菌肥的研制打下基礎,并為黃河三角洲人工林的栽培管理及地力維護提供參考。

1 研究地概況

研究地區位于山東省東營市河口區(37°59′14″—37°88′23″N,118°53′27″—118°55′41″E),屬暖溫帶半濕潤地區,大陸性季風氣候；年均氣溫為12.3℃,極端最高氣溫為41.9℃,極端最低氣溫為-23.3℃,無霜期206 d,≥10℃的積溫約4300℃；年平均日照時數為2590—2830 h,太陽輻射年總量5146—5411 MJ/m2；年均降水量為530—630 mm,其中70%分布在夏季,且多暴雨,易形成旱、澇災害；平均蒸散量為750—2400 mm。地下水位約1.5 m,水質礦化度較高[12- 13]。

人工林為1985年營建,人工林株行距為3 m×3 m。栽植樹種主要有刺槐、榆樹、白蠟、臭椿、楊樹(Populs)、國槐(Sophorajaponica)、苦楝(Meliaazedarach)、檉柳(Tamarixchinensis) 林等。林下生長有茅草(Imperatacylindica)、荻(Triarrhercasaccharifora)、牽牛(Pharbitisnil)等草本植物。

2 材料及方法

2.1 樣品采集

2014年11月在刺槐(CH)、榆樹(YS)、白蠟(BL)、臭椿(CC)4種人工林中分別設置3個標準地,標準地大小為20 m×20 m,共12個標準地。每個標準地內以梅花形采樣法分別設置5個樣點,在每個采樣點去除地表植被和枯枝落葉后采集0—20 cm土層的土壤,將每個標準地獲取大約等量的土壤分別混勻。實驗共采集12份土樣,液氮保存帶回實驗室。用于測定細菌多樣性的土壤于-70℃條件下保存備用；用于理化性質測定的土樣,作風干過篩處理,并用環刀法取樣用于測定土壤含水量。

2.2 土壤理化性質測定

土壤電導率采用電導法測定(水土比為1∶5)；土樣pH的測定采用電位法(水土比為1∶2.5)；用環刀法測土壤含水量；速效氮的測定采用堿解擴散法；速效磷的測定采用浸提鉬銻抗比色法；速效鉀含量測定采用火焰光度法；用重鉻酸鉀氧化-外加熱法測有機質。

2.3 土壤微生物DNA提取、測序、處理

采用 Powersoil DNA Isolation Kit(MoBio, USA)提取土壤總DNA[14],經紫外分光光度計測定其濃度和純度后,再用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品的完整性,最后置于-20℃冰箱中保存備用。采用16S V4區引物515F-806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對16S V4高變區片段進行擴增,PCR條件如下：98℃預變性30 s,98℃變性30 s,50℃退火30 s,72℃延伸30 s循環27次,最后72℃延伸5 min。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后4℃保存備用。用New England Biolabs公司的NEB Next? UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina建庫試劑盒進行文庫的構建,構建好的文庫經過Qubit定量和文庫檢測合格后,使用MiSeq進行上機測序。

IlluminaMiSeq測序平臺得到的下機數據(Raw Data)存在一定低質量數據,會干擾分析結果,因此在進行下一步分析前,根據Barcode序列將下機數據拆分為不同的樣品數據,截去Barcode序列和PCR擴增引物序列；將拆分的數據使用FLASH對每個樣品的reads進行拼接,得到的拼接序列為原始Tags數據(Raw Tags)；Raw Tags經過更嚴格過濾處理后[15],得到高質量的Tags數據(Clean Tags):Raw Tags從連續低質量值(默認質量閾值為3)堿基數達到設定長度(默認長度值為3)的第一個低質量堿基位點截斷；Tags經過截取后得到的Tags數據集,進一步過濾掉其中連續高質量堿基長度小于Tags長度75%的Tags[16]。經過以上處理后得到的Tags序列與數據庫(UCHIME Algorithm)進行比對[17],檢測嵌合體序列并最終去除其中的嵌合體序列[18]。

2.4 物種注釋與豐度計算

利用Uparse軟件將所有樣品的全部Effective Tags序列聚類分析[19],默認97%的一致性將序列聚類成為OTUs,Uparse構建OTUs時選取具有代表性序列(依據其算法原則,篩選的是OTUs中出現頻數最高的序列),將代表性序列集合用RDP Classifier與GreenGene數據庫進行物種注釋分析。結合物種組成信息結果,得到每個物種在樣品中的豐度。

2.5 多樣性計算

根據每個樣本文庫的OTUs豐度信息,利用QIIME(Version1.7.0)軟件計算樣品的多樣性值,包括物種數、Chao1指數、Shannon指數[20]。應用 SPSS 22.0軟件分析細菌豐度差異,各處理間數據采用方差分析(ANOVA),以Duncan 法檢測差異顯著性,顯著差異水平P<0.05,極顯著差異水平P<0.01。

圖1 細菌稀釋曲線分析

3 結果與分析

3.1 測序數據分析

從黃河三角洲臭椿、榆樹、白蠟、刺槐4種人工林土壤中分別獲得31281、55702、23281、26316條原始序列,其中有效序列分別為30964、54236、23146、25949條。對獲得的有效序列進行隨機抽樣,以抽到的序列數與其所代表的OTU數目構建稀釋性曲線,如圖1。從圖中得知,4種人工林土壤樣品的稀釋性曲線均趨于平坦,表明測序數據合理,更多的測序數據對發現新的OTU貢獻率較小。

3.2 人工林土壤細菌群落結構

在相似水平為97%的條件下,與Gold database數據庫對比,對所得序列進行聚類分析,結果見圖2。結果表明,4種人工林土壤細菌共有31門,其中刺槐、榆樹、白蠟、臭椿人工林土壤中分別有24、28、25、26門細菌。4種人工林土壤中酸桿菌門(Acidobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)細菌以及刺槐、臭椿人工林土壤中的硝化螺旋菌門細菌相對豐度均超過10%,是人工林土壤中的優勢群落；另外硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、浮游菌門(Planctomycetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)5門細菌在人工林土壤中相對豐度超過1%,是土壤中的主要細菌群落。榆樹、白蠟人工林土壤中酸桿菌門細菌豐度最高,分別為41.56%、49.20%,顯著高于刺槐、臭椿人工林土壤中酸桿菌門細菌豐度(P<0.05)。在刺槐、臭椿人工林土壤中變形菌門細菌豐度最高,分別為29.92%、35.28%。除酸桿菌門、變形菌門細菌外,硝化螺旋菌門、芽單胞菌門、擬桿菌門(Bacteroidetes)、廣古菌門(Euryarchaeota)、泉古菌門(Crenarchaeota)、藍藻菌門(Cyanobacteria)6門細菌在4種人工林土壤中豐度差異顯著。WPS-2、NC10細菌為榆樹人工林土壤特有細菌。

3.3 人工林土壤細菌多樣性

4種人工林土壤細菌多樣性分析結果見表1。刺槐人工林土壤細菌多樣性顯著高于其他3種人工林,物種數、Chao1指數、Shannon指數分別為1769.55、2526.61、8.75。榆樹、臭椿人工林土壤細菌多樣性顯著高于白蠟人工林,榆樹、臭椿人工林之間土壤細菌多樣性差異不顯著。4種人工林中白蠟人工林土壤細菌多樣性最低,物種數、Chao1指數、Shannon指數分別為1571.47、1824.20、8.35,顯著低于其他3種人工林。

3.4 人工林土壤理化性質

不同人工林土壤理化性質見表2。4種人工林土壤電導率介于128.71—138.54 us/cm；人工林土壤為堿性(pH均大于8.3),臭椿人工林土壤pH值最高,顯著高于其他3種人工林。刺槐人工林土壤有效磷含量顯著高于其他3種人工林,為3.47 mg/kg；榆樹、白蠟、臭椿人工林有效磷含量分別是刺槐人工林的33.72%、39.48%、43.52%。榆樹人工林土壤堿解氮、有效磷、速效鉀、有機質含量均顯著低于其他3種人工林。4種人工林中臭椿人工林土壤含水量、速效鉀、堿解氮、有機質含量最高,其中臭椿人工林土壤含水量、有機質含量顯著高于其他3種人工林；刺槐、榆樹、白蠟人工林土壤含水量分別是臭椿人工林的57.56%、51.22%、48.47%,有機質含量分別是臭椿人工林的45.54%、32.65%、49.33%。

表1 人工林細菌群落多樣性分析

CC,臭椿人工林,A.altissimaplatations；YS,榆樹人工林,U.pumilaplatations；BL,白蠟人工林,F.velutinaplatations；CH,刺槐人工林,R.pseudoacaciaplatations;同列不同小寫字母表示在0. 05水平差異顯著

表2 不同人工林土壤理化性質

3.5 細菌群落與土壤理化性質

分析表3得知,細菌物種數與土壤有效磷含量呈極顯著正相關關系,與速效鉀含量呈顯著負相關關系；Chao1指數與pH、有效磷含量呈顯著正相關關系；Shannon指數與土壤電導率呈顯著負相關關系,與土壤含水量、有效磷含量呈顯著正相關關系,與pH呈極顯著正相關關系。

土壤電導率與酸桿菌門、浮游菌門細菌豐度呈顯著正相關關系,與硝化螺旋菌門細菌豐度呈極顯著負相關關系,與芽單胞菌門細菌豐度呈顯著負相關關系。土壤pH與變形菌門、硝化螺旋菌門、芽單胞菌門細菌豐度呈極顯著正相關關系,與酸桿菌門細菌豐度呈極顯著負相關關系。土壤含水量與酸桿菌門、綠彎菌門細菌豐度呈顯著負相關關系；有機質含量與酸桿菌門細菌豐度呈顯著負相關關系；土壤含水量、有機質含量與變形菌門、硝化螺旋菌門、芽單胞菌門細菌豐度呈顯著正相關關系。有效磷含量與放線菌門細菌豐度呈顯著正相關關系。

表3 細菌群落與土壤理化性質相關關系

*與** 分別表示達到5%和1%的顯著水平

4 討論

土壤環境是植物-土壤-土壤生物組成的特殊微環境。鑒于土壤細菌群落結構及多樣性在生態系統中的重要意義,細菌結構及多樣性研究逐漸受到關注。由于土壤細菌群落結構復雜、數量巨大以及傳統研究方法技術的限制,對細菌群落的了解不夠深入。近幾年發展的高通量測序技術有助于高效、全面的認識土壤微生物群落。黃河三角洲人工林經過三十多年生長,其根系分泌物、凋落物以及組織滲濾液多年輸入土壤,必然深刻改變著人工林土壤理化性質和微生物群落結構。探索不同人工林土壤細菌群落及多樣性差異,對于黃河三角洲地區人工林營建及管理具有重要意義。

4.1 土壤細菌群落與植被類型

植被類型和土壤細菌群落之間相互影響、相互適應。土壤細菌群落類型和結構因植被不同存在差異,細菌在土壤中的分布也和細菌的生態幅有關。例如許多研究表明酸桿菌門、變形菌門、放線菌門細菌是不同植被土壤中的優勢群落[5, 19- 20],王伏偉等、楊菁等研究表明變形菌門、酸桿菌門、放線菌門細菌分別是麥田、不同降香黃檀混交林土壤中的優勢群落[5,21]。本研究也顯示酸桿菌門、變形菌門、放線菌門細菌是黃河三角洲4種人工林土壤中優勢群落。這應該與酸桿菌門、變形菌門、放線菌門3門細菌的生態幅較寬,其分布受環境影響較小有關,植被類型的改變對土壤中酸桿菌門、變形菌門、放線菌門3門細菌的影響較小,所以這3門細菌在不同植被土壤中均表現為優勢群落[22- 23]。

不同樹種組成的植被,影響著土壤中的細菌結構和多樣性。本研究顯示黃河三角洲4種人工林土壤細菌結構、多樣性存在一定差異。如刺槐人工林土壤細菌多樣性顯著高于其他3種人工林；酸桿菌門、變形菌門、硝化螺旋菌門、芽單胞菌門、擬桿菌門、廣古菌門、泉古菌門、藍藻菌門細菌在4種人工林土壤中豐度差異顯著。楊菁等關于4種降香黃檀混交林土壤細菌多樣性研究發現降香黃檀母生混交林土壤細菌多樣性顯著低于其他混交林,劉秉儒等研究表明地上植被類型影響土壤中細菌群落結構及豐度[5, 24]。作為土壤中細菌營養物質的主要來源,人工林凋落物以及根系分泌物種類、數量存在差異,特別是不同樹木根系分泌物中的類黃酮、酚類化合物、檸檬酸、蘋果酸、草酸、阿魏酸、氫氰酸、苯甲酸、肉桂酸、皂角苷等成分差異較大,另外不同樹木根系生長代謝及凋落物基質質量也存在不同,根系代謝及凋落物分解會影響人工林土壤的透氣性、含水量、pH、土壤顆粒大小、土壤緊實度及土壤中N、P、K、有機質含量等理化性質,細菌群落從土壤中獲得的營養物質及其土壤生存環境存在差異,因此地上植被類型能夠通過凋落物、根系分泌物在一定程度上影響土壤細菌群落,即植物對細菌群落具有一定的選擇作用[24]。

4.2 細菌群落與土壤理化性質

土壤特性差異對細菌種類及組成具有一定影響。其中土壤pH能夠直接或間接影響土壤細菌群落結構及多樣性,pH能夠以直接影響土壤細菌生理代謝、改變微生物群落間競爭關系或抑制非適應性微生物生長等方式,改變土壤細菌群落[25]。有研究表明酸桿菌門細菌在不同pH土壤中相對豐度不同[20,26]。如隋心等研究發現在三江平原土壤(pH介于5.39—5.85)中酸桿菌門豐度為53%[26]；柳春林等在鼎湖山研究表明森林土壤(pH介于3.00—4.50)中酸桿菌門細菌豐度介于53.3%—67.8%[20]。黃河三角洲4種人工林土壤(pH介于8.35—8.52)中酸桿菌門細菌豐度低于隋心、柳春林等研究結果,介于20.38%—49.20%。有研究表明酸桿菌門細菌在酸性土壤中豐度較高,堿性土壤中較低[20]。黃河三角洲人工林土壤pH與酸桿菌門細菌豐度呈極顯著負相關關系。酸桿菌門是嗜酸性細菌,酸性土壤環境有利于酸桿菌門細菌的代謝活動,鼎湖山與三江平原土壤為酸性,適于酸桿菌門細菌的生長,而黃河三角洲土壤為堿性不利于酸桿菌門細菌生長,因此人工林土壤中酸桿菌門細菌豐度較低[20]。另外在堿性土壤環境中酸桿菌門細菌豐度較低,減小了土壤中其他細菌的競爭壓力,其他細菌可以從土壤中競爭得到更多的營養物質及其他資源,因此黃河三角洲4種人工林土壤中變形菌門、硝化螺旋菌門、芽單胞菌門3門細菌豐度與土壤pH呈顯著正相關[26-27]。

黃河三角洲刺槐、臭椿人工林土壤細菌群落中變形菌門細菌相對豐度最高。變形菌門細菌是土壤環境中的一大類細菌群落,其中部分變形菌門細菌能夠利用有機物分解產生的氨氣、甲烷等營養物質進行生長代謝活動[28]。4種人工林中臭椿人工林土壤變形菌門細菌相對豐度最高,有機質含量顯著高于其他3種人工林；相關性分析表明變形菌門細菌與土壤有機質含量成正比,這與變形菌門細菌利用土壤有機質能力的特性相符,即有機質含量較高的土壤中有利于變形菌門細菌生長[28]。芽單胞菌門細菌(Gemmatimonadetes)在其他地區研究中未發現或者豐度極低,如三江平原小葉章土壤中芽單胞菌門豐度只有1%[5,26]。黃河三角洲4種人工林土壤中芽單胞菌門細菌豐度較高,為4.74%—5.67%,而且研究結果表明芽單胞菌門細菌相對豐度與土壤電導率呈極顯著正相關。這可能是因為部分芽單胞菌門細菌具有耐鹽或嗜鹽的特性,因此適宜在含鹽量較高的黃河三角洲土壤中生長,相對豐度較高[29-30]。

黃河三角洲是由黃河攜帶泥沙長期淤積而形成的濱海沖擊平原,土壤含鹽量普遍較高,而且土壤肥力較差,土壤中微生物和其他地區土壤相比有較大的差異。土壤微生物是生態系統的重要組成部分,在生態系統中的物質循環等生態過程中發揮著重要的生態功能。在黃河三角洲人工林營建過程中如何管理好這一生態系統,使其能夠穩定、健康的生長,發揮其改善生態環境的作用,清楚認識人工林土壤中的微生物差異和特性并在管理中加以人工調控就顯得非常重要。由于黃河三角洲土壤鹽堿含量高,適合在這一地區生長的喬木樹種較少,選擇黃河三角洲常見的4種較耐鹽堿樹種營建的人工林,利用目前較為先進的高通量技術對其細菌群落結構和多樣性進行研究,進一步了解在這一特殊區域營建的人工林土壤細菌的特性,為在人工林的精細管理中土壤微生物的調控及將來微生物肥料的制備提供一定參考依據。本研究主要對4種人工林從門水平上對土壤細菌多樣性特征進行了研究,隨著研究的進一步深入,還需要更精確地對土壤中細菌從綱、科、屬、種等不同水平進行更為深入的研究,為人工林的精細化管理奠定基礎。