晚期EGFR突變型非小細胞肺癌接受埃克替尼治療療效和循環腫瘤細胞的關系

黃韻堅，黃誠，莊武，徐海鵬，黃章洲，徐振武，吳標，許春偉，陳剛

（1.福建醫科大學附屬福建省腫瘤醫院胸部腫瘤內科，福建 福州 350014；2.福建醫科大學附屬福建省腫瘤醫院病理科，福建 福州 350014）

在世界范圍內，肺癌是死亡率最高的癌種，其中非小細胞肺癌占肺癌的85%[1]。早期肺癌手術治療可以明顯延長患者的生存時間。然而，由于肺癌早期癥狀并無特異性，大多數患者就診時已伴有腦、骨、腎上腺、肝等遠處轉移，如無法進行手術，通常預后較差。術后切除的Ⅰ～ⅢA期肺癌患者5年生存率只有30%～40%[2]，總體5年生存率只有15%，大多數肺癌患者死于復發和遠處轉移[3]。

隨著晚期非小細胞肺癌分子靶向治療不斷改善和新方法的不斷運用，表皮生長因子受體（EGFR）基因是靶向治療中研究最多的，EGFR-TKIs在腫瘤中對靶向EGFR基因靶點至關重要，目前EGFR-TKIs已一線用于EGFR基因突變型晚期非小細胞肺癌的治療，但是由于耐藥性的存在限制了這些藥物的使用。目前，腫瘤的檢測以及治療的監測依靠于影像學和血清標志物的檢查。但是影像學揭示腫瘤大小依然不能與惡性程度以及侵襲和轉移能力相適應[3]。目前缺乏一個監測EGFR-TKIs療效的高度敏感性和高度特異性的標志物能夠自動評估EGFR-TKIs療效和實時監測腫瘤復發與轉移。因此，我們需要一種方法可以動態地評估EGFR-TKIs效果，延長生存時間，避免過度或延遲治療。目前針對EGFR基因突變的一代EGFR-TKIs有吉非替尼、厄洛替尼和埃克替尼，其中埃克替尼是我國第一個具有知識產權的小分子靶向抗癌新藥，對晚期NSCLC的治療效果與國外抗腫瘤靶向藥物的療效相仿，并且安全性更好[4-6]。

與腫瘤預后相關腫瘤轉移認為是來自外周血的循環腫瘤細胞（CTC）[7-8]。此外，CTC的數目與肺癌密切相關[9-10]。近年來微創的方法被用來評估之前化療的療效和CTC數量被發現與小細胞肺癌化療療效相關[11]。然而EGFR-TKIs治療領域里尚未達成CTC計數EGFR-TKIs治療效果評估和預后方面的評估。因此，我們使用接受埃克替尼治療的晚期非小細胞肺癌患者外周血CTC作為研究對象，探索CTC計數埃克替尼在晚期非小細胞肺癌預后效果中的評價。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 我們前瞻性入組福建省腫瘤醫院2015年4月～2016年8月間診斷為晚期非小細胞肺癌患者并計CTC數目。入組標準：①年齡≥18歲，≤80歲，預期壽命≥12周；②WHO體力狀態評分（PS）0～2級；③未接受治療的ⅢB～Ⅳ期新發腫瘤患者或復發轉移患者；④EGFR基因檢測突變型；⑤能夠依從研究要求和隨訪程序，簽署知情同意書。排除標準：①重要的血管疾病或任何嚴重心臟病患者；②不愿簽署知情同意書的患者；③不愿接受隨訪的患者。本研究中74例患者組織采用ARMS法檢測EGFR基因檢測發現第19外顯子缺失和第21外顯子L858R突變。

1.2 患者治療 患者采用埃克替尼（浙江貝達藥業有限公司，規格：125 mg，批號：15051923），口服每次125 mg，每天3次，治療持續至少1個月，最長治療29個月，平均治療8個月。隨訪至2017年9月，74例患者中53例患者達到中位總生存時間，21例密切隨訪中。

1.3 樣本收集和CTC檢測 收集患者治療前和治療后1個月外周血樣本，每次采血5 ml。本研究采用廣州益善公司開發的CanPatrolTM方法檢測并計數CTC數量，具體步驟如圖1。

圖1 CanPatrolTM方法CTC檢測步驟Figure 1 CanPatrolTM method CTC detection steps

1.4 CTC判定標準 本研究采用多重RNA探針，分別針對多種CTC特異性基因，通過不同顏色熒光信號將CTC分型：細胞內CD45（-）、EpCAM（+）和CK8/18/19（+）時，顯微鏡下可見紅色熒光信號，為上皮型CTC；細胞內CD45（-）、Vimentin（+）和Twist（+），顯微鏡下可見綠色熒光信號，為間質性CTC；細胞內同時顯示紅色熒光及綠色熒光信號的則為混合型CTC，見圖2。

圖2 熒光顯微鏡下CTC分型（左：上皮型；中：間質型；右：混合型）Figure 2 CTC type under fluorescence microscope(left:epithelial type;middle:interstitial type;right:mixed type)

1.5 統計學方法 CTC與非小細胞肺癌患者臨床病理參數之間的關系采用t檢驗。統計學處理無進展生存期（progression-free survival，PFS）用Kaplan-Meier法進行分析，使用Log-rank法進行單因素預后分析，PFS指從埃克替尼治療至第一次發生疾病進展或任何原因死亡的時間。所有統計使用SPSS 19.0統計軟件進行分析，計量資料進行t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CTC數目與臨床特征的關系 患者特征如表1。其中男47例，女27例，平均年齡（60.4±6.9）歲，組織學類型腺癌65例，鱗癌4例，其他類型5例，根據TNM分期，其中ⅢB期6例，Ⅳ期68例，PS評分0～1分49例，≥2分25例。CTC數量與性別、年齡、吸煙史、組織學類型和臨床分期比較差異均無統計學意義，見表1。

表1 晚期非小細胞肺癌中CTC數據與臨床特征的關系Table 1 The relationship between CTC data and clinical features in advanced non-small cell lung cancer

2.2 CTC數量與埃克替尼治療安全性 CTC數量見表3。本研究中患者CTC數量在0～187，基于我們的實驗數據，我們所有患者CTC中位數量在13并作為分界點，分為低數量組和高數量組。CTC低數量組ORR為46.88%，DCR%為78.13%；CTC高數量組ORR為23.81%，DCR為38.10%，見表2。

表2 CTC數量與埃克替尼療效的關系Table 2 The relationship between the number of CTC and the efficacy of ectopic

2.3 埃克替尼治療前后CTC數量的比較 74例患者中，45例患者有效（CR+PR+SD），且治療前后CTC數量變化差異有統計學意義（P=0.011）。但另外29例無效患者（PD）中，治療前后CTC數量變化無統計學意義（P=0.083），見表3。

表3 埃克替尼治療前后CTC數量變化（±s）Table 3 The changes in CTC count before and after treatment with ectopic(±s)

表3 埃克替尼治療前后CTC數量變化（±s）Table 3 The changes in CTC count before and after treatment with ectopic(±s)

療效有效無效例數45 29治療前5.4±5.6 49.3±73.7治療后4.0±3.3 27.2±59.1 t值2.32 1.47 P值0.011 0.083

2.4 CTC數量與預后的關系 本研究中74例患者，總體中位OS為21.5個月（95%CI：18.4～24.4個月），CTC低數量組中位OS為22.0個月（95%CI：19.6～28.7個月），CTC高數量組中位OS為18.3個月（95%CI：15.3～25.4個月）。總體的中位PFS為7.6個月（95%CI：5.3～9.4個月），CTC低數量組中位PFS為11.6個月（95%CI：8.7～15.6個月），CTC高數量組中位PFS為7.2個月（95%CI：3.4～8.7個月）。埃克替尼治療后，EGFR基因19del組ORR為41.03%，DCR為61.54%，L858R組ORR為25.71%，DCR為42.86%，見表4。

圖3 晚期非小細胞肺癌總OSFigure 3 Total OS of advanced non-small cell lung cancer

圖4 晚期非小細胞肺癌中CTC數量與生存的OSFigure 4 The number of CTC and OS of survival in advanced nonsmall cell lung cancer

圖5 晚期非小細胞肺癌總PFSFigure 5 Total PFS of advanced non-small cell lung cancer

圖6 晚期非小細胞肺癌中CTC數量與生存的PFSFigure 6 The number of CTC and PFS of survival in advanced nonsmall cell lung cancer

表4 埃克替尼對EGFR基因不同突變位點揭示不同療效Table 4 Eecinib reveals different therapeutic effects on different mutations in EGFR gene

3 討論

CTC首次被描述是基于其與腫瘤細胞相似[12]，在惡性增殖和發展過程中腫瘤細胞可能改變DNA或蛋白來實現上皮間質轉換，以及入侵外周循環系統形成轉移性CTC[13]。化療是晚期非小細胞肺癌主要治療方法，但通常療效較低。研究表明CTC數量與治療療效無關[8]，埃克替尼可以治療化療一線失敗的晚期非小細胞肺癌患者，在腫瘤細胞中，EGFR基因通常表現為突變或過表達[14]，而埃克替尼可以通過凋亡形式阻礙EGFR蛋白過表達[15]。由于埃克替尼治療延長EGFR基因突變的非小細胞肺癌患者PFS和OS時間，EGFR-TKI已經作為EGFR基因突變的晚期非小細胞肺癌一線治療。但是，埃克替尼治療后不可避免的出現靶向治療耐藥，而EGFR基因20外顯子T790M經常占主導，這種突變能夠增加EGFR和ATP之間的親和力，正因為如此，可逆的TKI無法輕易抑制EGFR磷酸化，MET基因擴增能夠激活ErbB3/PI3K/AKT信號通路引起EGFR激酶抑制劑[16]。因此，知道埃克替尼有效對治療和預后非常重要。

晚期非小細胞肺癌患者CTC的數量較少，特別是進展期的較早階段。正因如此，我們需要建立一個準確可靠并能重復的技術方法來檢測外周血中的CTC。CanPatrolTM系統是目前唯一可以同步實現CTC形態分型、細胞分型和分子分型的先進檢測技術，該系統主要通過納米過濾技術來富集CTC，而不需要依賴特異生物標志物（如EpCAM），從而可以減少非小細胞肺癌患者CTC的丟失，具有高靈敏度、高特異性、可重復性等優點[17]。本研究數據揭示埃克替尼在CTC低數量組比CTC高數量DCR明顯偏高，有效組CTC數量在治療前和治療后差異有統計學意義（P＜0.05）。這些數據支持CTC數量可以預測治療結果[18-19]。中位PFS值CTC低數量組比CTC高數量要明顯延長，差異具有統計學意義（P＜0.05）。這些數據提示埃克替尼對治療療效和疾病控制效果更好。這是CTC數量與晚期非小細胞肺癌接受埃克替尼治療預后相關的有力證據。因此，CTC數量可以用于治療決策。但本研究樣本量過小，我們需要更大樣本量來驗證我們的結果。

CTC低數量的晚期EGFR突變型非小細胞肺癌患者使用埃克替尼可以取得更好的療效，CTC數量及治療前后變化情況或可作為埃克替尼療效的預測指標。