除草劑阿特拉津對斑馬魚胚胎毒性的研究

郝明嬌 王靜慧 王 豐 董 武 段莉梅＊

（1.內蒙古民族大學化學化工學院，內蒙古 通遼 028000；2.內蒙古民族大學動物技術學院，內蒙古 通遼 028000）

0 引言（Introduction）

阿特拉津作為除草劑在農業中廣泛使用,是一種三嗪類除草劑[1]。由于其廣泛的應用，導致了巨大的生態和人類健康問題[2]。阿特拉津有內分泌干擾毒性，一些研究表明阿特拉津被認為是一種潛在的致癌物質[3]。近年來,阿特拉津因使用量大、殘留期長、環境水體中檢出率高和具有內分泌干擾作用等而受到廣泛關注[4]。

經調查，我國河流，土壤中都發現了有阿特拉津的殘留。陶俊[5]等人在低濃度暴露下，阿特拉津對鯽魚基因組DNA的損傷無明顯的劑量-效應關系，阿特拉津毒性在0.375mg·L-1時突然增強，但這一趨勢并未向更高濃度組延續 (1.5mg·L-1組表現出的毒性弱于 0.375mg·L-1組和3mg·L-1組 )。

斑馬魚是一種小型的熱帶淡水魚，因其產卵量多、早期胚胎發育透明且易于觀察、對化學物質有著很強的敏感度，已逐漸成為最有價值實驗動物模型。本實驗使用斑馬魚作為模型，探討了除草劑阿特拉津對斑馬魚的毒性，特別是有關形態學以及相關基因的影響。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 儀器與試劑

儀器：電子分析天平（BS2245北京賽多利斯儀器系統有限公司)；5415R型臺式離心機(Eppendorf公司)；數碼照相機 DXM1200；倒置顯微鏡 E600，Eclipse Net圖像分析軟件(Nikon公司)。

藥物：阿特拉津為97%原藥 (濟南科賽基農化工有限公司)；二甲基亞砜溶液等其他藥物均來源于美國Sigma公司。

1.2 動物實驗以及染毒方法

斑馬魚(Danio rerio,AB 系)，飼養于玻璃容器中，水溫 28.5℃，光照周期為 14h·d-1。實驗前一天晚上，分別取4條雌魚和8條雄魚混養。第二天自然交配后，挑出發育正常的受精卵，受精后4h(4 hour post fertilization，4 hpf)進行暴露實驗。實驗于直徑為 3cm 的六孔板中進行。暴露濃度中均含有20粒胚胎，每組進行3次平行實驗。暴露濃度分別為:DMSO(0.1%)對照組，10，20，30，50mg/L的阿特拉津。染毒暴露開始后，將斑馬魚胚胎移入28.5℃孵化箱進行培養。

1.3 形態學觀察

斑馬魚胚胎在 4hpf開始染毒，分別在 24，48，72hpf觀察和記錄死亡率，孵化率和畸形率。

1.4 軟骨染色

取72hpf斑馬魚幼魚，用10%甲醛固定，4℃過夜；Alcian blue 8GR染色，室溫過夜；使用95%、90%、80%、70%、50%酒精及蒸餾水各洗30min；用蛋白酶消化 30-60min，0.5%KOH和 H2O2脫色 1h,觀察是否已經透明；水洗，70%甘油永久保存。

1.5 數據處理

采用SPSS19.0軟件對試驗數據進行單因素方差分析及LC50的計算。

2 結果與討論（Results and Discussion）

圖(a)為阿特拉津對斑馬魚死亡率的影響。對照組，10，20，30，50mg/L阿特拉津的死亡率分別為 0%，0%，13.33%，56.67%，100%。 其中 20，30，50mg/L阿特拉津染毒組死亡率與對照組有顯著性差異。LC50=28.46mg/L。結果表明，斑馬魚死亡率與阿特拉津染毒濃度呈正相關。

圖(b)為阿特拉津對斑馬魚孵化率的影響。對照組，10，20，30，50 mg/L阿特拉津的孵化率分別為 100%，83.3%，73.3%，33.33%，0%。 其中 10，20，30，50mg/L 阿特拉津染毒組,孵化率率與對照組有顯著性差異。

圖(c)為阿特拉津對斑馬魚脊索彎曲率的影響。對照組，10，20，30，50mg/L 阿特拉津的孵化率分別為0%，0%，20%，66.67%，100%。 其中 20，30，50mg/L阿特拉津染毒組脊索彎曲率與對照組有顯著性差異。

通過對除草劑阿特拉津給斑馬魚胚胎染毒，發現了阿特拉津不僅有毒性，可以使斑馬魚脊索彎曲，而且隨著濃度的增加可以使斑馬魚致死。使用低濃度的阿特拉津顯著抑制了斑馬魚的孵化，這種抑制具有一定的濃度依存性。當阿特拉津的濃度不斷增加時，畸形率和死亡率也逐級增加。

本試驗說明阿特拉津的致毒致畸性非常嚴重，作為一種廣泛使用的除草劑，我國應該給予足夠的重視，同時也說明了斑馬魚作為農藥對早期胚胎影響的預警有重要的意義。

3 結論（Conclusions）

（1）阿特拉津對斑馬魚的 LC50=28.46mg/L，斑馬魚死亡率與濃度呈正相關。

（2）阿特拉津會降低斑馬魚得孵化率，并與濃度呈正相關。

（3）阿特拉津會引起斑馬魚特異性脊索彎曲。