白·紅花生衣多酚物質含量分析方法及提取技術優化

2015-03-18 05:38:12裴云逸

安徽農業科學 2015年30期

裴云逸

(玉溪農業職業技術學院，云南玉溪653106)

花生為人們的日常食品，也是保健食品。花生衣最常見為呈粉白色和紅褐色2種，一般稱白皮和紅皮。花生衣中含有多種具有生理活性的多酚類物質，對此方面近年來研究較多，主要包括花生衣紅色素、原花青素的提取，花生衣色素的抗氧化性研究，關于花生衣多酚組成的報道［1－2］，關于通過HPLC-MS技術分離鑒定出花生衣原花青素二聚體和三聚體的報道［3－4］，以及有關花生衣原花青素更詳細的報道［5］，如每100 g花生皮含兒茶素約16．1mg，原花青素二聚體約111．3 mg，三聚體約 221．3 mg，四聚體約 296．1 mg，而關于花生衣多酚的主要成分分析報道很少。

超聲輔助提取與微波輔助提取是對植物多酚類物質提取研究較早的2種技術［6－7］，這2種提取方法具有省時、高效、節約溶劑等特點。超聲輔助提取主要利用了超聲波的機械振動作用和空化作用促使有效成分進入溶劑中;微波輔助提取主要利用微波的熱效應使細胞內產生急劇壓力而破裂，有效成分溢出，同時微波的電磁效應加劇了植物細胞內分子運動，也有助于有效成分的浸出［8］。

筆者對2種輔助提取方法進行對比，并就微波輔助提取采用相同功率輻射法，使得微波輔助提取以控制物料最終溫度為基本方法。植物多酚物質含量測定多采用福林酚比色法(Folin-ciocaheu法)或酒石酸鐵法，以沒食子酸為對照。二者均用于測定具有不同光譜特征的黃酮類化合物的總含量。試驗根據花生衣多酚的光譜特征，采用了紫外法，使得花生衣多酚的測定簡潔化。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 供試原料與試劑。紅、白衣花生，玉溪本地農貿市場購買;兒茶素對照品，HPLC≥98%，上海金穗生物科技有限公司;原花青素對照品，HPLC≥98%，上海金穗生物科技有限公司;無水乙醇，優級純，天津市鳳船化學試劑科技有限公司;鹽酸，優級純，廣東西隴化工有限公司;超純水，玉溪農業職業技術學院實驗室自制。

1．1．2 主要儀器設備。超聲波清洗器，DS-3510 DTH，上海生析超聲儀器有限公司;家用微波爐，G80F20，廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司;紫外可見分光光度計，UV2550，島津儀器(蘇州有限公司);電子天平，BT124S、BT2202S，北京賽多利斯儀器有限公司;可調溫電熱套，SXKW，北京永光明醫藥儀器廠;家用多功能料理機，CX-301，中山市九陽小家電有限公司。

1．2 方法

1．2．1 原料處理。秋后收新花生去殼后即可剝皮。干花生仁用少量水噴潮濕，手工剝皮，剝好的花生皮自然晾干后，用家用料理機粉碎，備用。

1．2．2 試驗方法。通過對比紅、白花生衣多酚物質與原花青素對照品、兒茶素對照品的光譜吸收圖像，結合黃酮類化合物的光譜吸收圖像特征，確定花生衣多酚物質以原花青素和兒茶素等單體為主。因此采用以原花青素和兒茶素系列溶液在280 nm下吸收值建立標準曲線為對照的紫外法來分析所提取多酚物質含量。采用單因素試驗優化超聲輔助提取和微波輔助提取條件，比較超聲輔助、微波輔助及振蕩三者提取的效果。

1．2．3 花生衣多酚物質紫外可見光譜特征分析。稱取0．05～0．08 g花生衣粉，用100ml60%的乙醇溶液常溫超聲輔助提取20 min，過濾，濾液經紫外可見分光光度計UV-2550于190～800 nm進行光譜掃描。同時將原花青素與兒茶素的對照品用無水乙醇配制成濃度為0．01～0．30 mg/ml的溶液(該試驗采用制作原花青素和兒茶素對照品標準曲線的系列溶液)，同法進行光譜掃描。

1．2．4 花生衣多酚物質含量分析方法。試驗根據花生衣多酚物質、原花青素和兒茶素均在280 nm處的紫外吸收特征，測定多酚物質在這一波長下的吸收值，再以原花青素或兒茶素標準曲線為對照，計算含量。原花青素和兒茶素標準曲線以下列方法制作:取原花青素或兒茶素對照品20mg，用無水乙醇配成1 mg/ml的標準儲備液20 ml，分別取儲備液0．1、0．5、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0、4．0ml于10ml容量瓶中，再用無水乙醇稀釋至 10 ml，即為 0．01、0．05、0．10、0．15、0．20、0．30、0．40mg/ml的標準系列，測定各標準系列在280 nm下的吸收值，制作原花青素或兒茶素吸收標準曲線。

1．2．5 超聲輔助提取與微波輔助提取條件及優化。由于花生衣中原花青素等多酚物質熱穩定性較差，微波提取主要利用微波的熱特性，所以采用家用微波爐在大劑量溶劑下提取，以防提取劑升溫過高迅速蒸發或沸騰從容器溢出。微波輔助與超聲輔助提取均采用80ml溶劑提取。

1．2．5．1 提取劑選擇。據諸多報道，當以乙醇為提取劑時60%乙醇效果較好［9－11］，所以該試驗采用60%乙醇為提取劑。

1．2．5．2 超聲時間的影響。每次試驗均準確稱取0．080 00 g花生衣粉，用80 ml 60%乙醇在45℃水浴溫度下浸泡10 min，再在此水浴溫度下超聲輔助提取不同時間，冷卻到室溫后定容至100ml，過濾，測定吸收值。再以50℃水浴溫度同法試驗。

1．2．5．3 超聲溫度的影響。選擇白、紅2種花生衣粉試驗，每組試驗以不同水浴溫度超聲輔助提取25 min，其余同“1．2．5．2”。

1．2．5．4 相同功率下微波時間或溫度的影響。將6份0．080 00 g花生衣粉分別用80 ml 60%的乙醇常溫下浸泡35min，在 100%功率(700 W)下提取 20、30、35、40、45、50 s，每次測定物料最終溫度，冷卻后定容至100 ml，過濾，測吸收值。

1．2．5．5 不同微波功率、相同微波輻射能量［以P(%)×t(s)表示］下提取效果比較。根據微波加熱原理，在微波電磁場下物料被加熱是因為物料吸收微波能(W=Pt)，由此設計在相同微波輻射能量下的提取試驗。根據“1．2．5．4”的試驗結果得出的最佳物料最終溫度，依次設計在100% ～20%微波功率下的試驗，每次試驗記下物料最終溫度。

1．2．5．6 微波輔助一次提取與二次提取比較。分別以100%和80%的微波功率在相同微波輻射能量下比較一次提取與二次提取的效果，其中二次提取是在一次提取冷卻到室溫后再進行。

1．2．5．7 超聲輔助、微波輔助與振蕩提取效果比較。對同一批花生衣粉分別用80 ml 60%的乙醇按照以下超聲、微波及振蕩條件提取。

超聲輔助提取:將0．080 00 g花生衣粉用80 ml 60%乙醇在55℃下超聲提取25 min。冷卻后定容，過濾，測吸收值，以兒茶素和原花青素對照曲線計算含量。

微波輔助提取:將0．080 00 g花生衣粉用80 ml 60%乙醇在室溫(當時冬天室溫10℃左右)下浸泡35 min，再分別以100%微波/35 s、80%微波/44 s、微波60%/58 s提取，冷卻至室溫后再以同樣方法進行二次提取，其他處理同超聲輔助提取。

振蕩提取:將0．080 00 g花生衣粉用55～60℃的80 ml 60%乙醇浸泡10min，再振蕩提取25min，其他處理同超聲輔助提取。

2 結果與分析

2．1 花生衣多酚物質光譜特性分析及含量分析方法確立從白、紅2種花生衣多酚物質紫外、可見光譜圖像特征，可以說明白、紅花生衣多酚物質以原花青素及兒茶素等單體為主。首先，比較白、紅2種花生衣多酚物質與原花青素、兒茶素溶液的紫外光譜圖像(圖1)，通過對吸收峰的選點檢測分析，白花生衣多酚物質的光譜圖像與兒茶素的光譜圖像的最大吸收峰很相似，分別在212和216 nm處出現最強吸收峰;紅花生衣多酚物質的光譜圖像與原花青素的光譜圖像的最大吸收峰很相似，分別在202和206 nm處出現最強吸收峰，而它們都在280 nm處出現特征吸收峰。其次，從2種花生衣多酚物質光譜圖像看不出有較明顯的蘆丁、桷皮素等其他黃酮類化合物的光譜特征，同時它們的光譜圖像與沒食子酸的光譜圖像也僅有280 nm處特征吸收峰的相同之處，而最大吸收峰完全不同［12－14］。張姣勤通過對幾個品種花生衣多酚物質的色譜分離圖像研究初步表明，花生衣多酚物質含大量的兒茶素和表兒茶素，此外含有少量酚酸類，以及微量桷皮素、蘆丁等，還有一種色譜峰最高的被推斷為原花青素［15］，這與筆者通過紫外可見光譜分析研究結果基本一致。說明花生衣多酚物質中主要含原花青素及兒茶素等單體，所以計算白、紅花生衣多酚物質的含量，可以以原花青素或兒茶素的280 nm吸收值為對照，通過標準曲線來計算含量。

2．2 花生衣多酚的超聲輔助提取條件選擇由圖2可知，當超聲輔助提取時間25 min時，2次試驗吸收值均最高，之后有所降低，因此選擇超聲輔助提取時間為25 min。由圖3可知，對于白、紅2種花生衣粉，當超聲輔助的提取溫度為55℃時吸收值最高。由此可以確定超聲輔助提取花生衣多酚物質在55℃下提取25 min效果最好。

2．3 花生衣多酚物質的微波輔助提取試驗結果由圖4～5以及表1～3可以得出:相同微波功率下，微波時間與物料最終溫度呈線性關系，由此可采用微波時間控制最終溫度。不同微波功率下，以相同微波輻射能量，即P(%)×t(s)值來控制提取溫度。當微波輔助提取溫度控制在60～68℃時，提取效果最為理想。

當微波功率大于30%時，以相同的微波輻射能量，即相同P(%)×t(s)值下提取同體積物料時，提取效果基本相同。物料最終溫度僅有微小差異，主要是由容器(該試驗使用100 ml燒杯)重量的差異所致容器吸熱不同而熱量損失不同引起。如果在平行試驗中讓提取容器的類型、體積和重量盡可能一致，溫度的差異將很小;當微波功率小于或等于30%時，物料最終溫度明顯低于前者，熱效應降低，提取效果也減弱，可見微波輔助提取主要是其熱效應的作用。

微波輔助提取時間除與微波功率有關外，還與實驗室室溫有關，在不同室溫下，物料的初始溫度不同，通過微波加熱到最佳提取溫度范圍需要的時間不同，具體需要通過試驗來確定。

微波輔助二次提取比一次提取測得的含量高0．44%，所以應采用微波輔助二次提取較為理想。

2．4 花生衣多酚物質超聲輔助提取、微波輔助提取及振蕩提取的比較試驗比較結果見表4，用3種方法提取的效果有所差異，其中超聲輔助提取和微波輔助提取的效果均比振蕩提取要好。以兒茶素為對照時超聲輔助提取比微波輔助提取高1．26%，微波輔助提取比振蕩提取高0．12%，以原花青素為對照時超聲輔助提取比微波輔助提取高0．95%，微波輔助提取比振蕩提取高0．25%。同時以兒茶素為標準測得多酚物質含量比以原花青素為標準測得含量要高。試驗采用微波輔助提取并以兒茶素為對照測得花生衣多酚物質含量與鄔建國等以及張姣勤采用微波輔助提取，福林酚法測得結果基本一致［15－16］。而用3種方法提取并以兒茶素為對照時測得含量均比吳克剛等采用一定濃度的乙醇直接提取，并用福林酚法要高一些［17］。

表1 相同微波輻射能量下以不同微波功率提取白花生衣多酚物質的效果

表2 相同微波輻射能量下以不同微波功率提取紅花生衣多酚物質的效果

表3 微波輔助提取次數對白花生衣多酚物質提取效果影響

表4 紅花生衣多酚物質的超聲輔助、微波輔助及振蕩提取效果比較

3 結論與討論

花生衣多酚物質的超聲輔助和微波輔助提取都是理想的提取方法，二者各有優缺點。超聲輔助提取操作過程較為復雜，比如，需要將超聲水浴加熱到指定溫度再倒入提取器中，還需要可控溫超聲提取器來控溫，同時也要將提取劑加熱到提取溫度再倒入容量瓶中，所有這些工作耗時而繁瑣。微波輔助提取在室溫下開始，在不到1min的時間即可完成，簡單而省時，但微波二次提取需要在一次提取后冷卻到室溫，再進行第二次提取;微波輔助提取采用相同微波輻射能量法，在不同微波功率下以微波時間控制提取液最終溫度，達到相同提取效果。花生衣多酚物質含量分析采用紫外法符合其光譜吸收特征，結果可靠。

［1］張秀堯，凌羅慶，戴榮興．花生衣的化學成分研究［J］．中國中醫雜志，1990，15(6):36 －38．

［2］林櫻姬．花生紅衣中多酚類物質的提取、純化與抗氧化、抑菌研究［D］．蘭州:蘭州理工大學，2010．

［3］陳洋，王冰，王佳男，等．RP-HPLC-ESI-MS/MS分離鑒定花生紅衣原花青素A 型和B 型二聚體［J］．食品科學，2013，34(23):142－146．

［4］杜蕾，李新華．黑、紅花生衣中原花色素的分析［J］．食品科學，2014，35(4):190 －194．

［5］孫慶杰．花生功能因子的研究與開發［D］．青島:青島農業大學，2011．

［6］周燕芳，丁利君．超聲波輔助提取艾葉黃酮的工藝研究［J］．食品與機械，2006，22(4):39 －41．

［7］謝貞建，趙超群，鄒聯柱，等．普洱茶多酚的提取及抗氧化作用研究［J］．食品與機械，2009，25(1):64 －67．

［8］鄧雪，黃惠華．微波輔助萃取中茶多酚的傳質機理和非熱效應的初步研究［J］．現代食品科技，2011，27(6):626 －629．

［9］張紅梅，金征宇，王靜．花生衣紅色素微波提取工藝研究［J］．安徽農業科學，2005，33(2):297 －299．

［10］陳杰，徐鶴龍．花生紅衣褐色素的提取工藝研究［J］．廣東農業科學，2007(9):76－78．

［11］童愈元，何東平．花生紅衣中紅色素、原花色素的提取工藝研究［J］．農業機械，2011(2):116 －119．

［12］張培成．黃酮化學［M］．北京:化學工業出版社，2009:239－243．