亮氨酸對正常人及2型糖尿病患者攝食獎賞中樞作用的靜息態功能磁共振研究

李美姣，劉華生，顧潛彪，鄧靈靈，段俊宏，梁琪，容鵬飛，王維

作者單位：

中南大學湘雅三醫院放射科，長沙410003

胰島素抵抗是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的重要發病機制[1]，T2DM患者多飲多食的攝食行為與患者胰島素抵抗互為因果[2]。在大腦中攝食行為主要由攝食中樞調控并與中樞獎賞系統相關，如何改善T2DM患者異常的攝食調控行為成為近期的研究熱點。既往多個研究證明亮氨酸可以通過作用于大腦引起攝食抑制，改善胰島素敏感性[3-9]，是目前所知唯一腦室內注射時能產生厭食反應的氨基酸[3，8]，但其對攝食中樞的具體調控機制尚不明確。Laron[10]認為異常的中樞胰島素信號傳導通路可導致食物攝取功能異常，Kulve等[11]研究發現，功能磁共振可顯示T2DM患者獎賞攝食相關腦區的過度激活。本研究利用靜息態功能磁共振成像(resting-state functional MRI，rs-fMRI)，研究攝食相關的腦區之間BOLD信號間相關性的特點以及T2DM患者給予亮氨酸刺激后攝食獎賞相關腦區的功能連接改變情況，以探索亮氨酸對健康志愿者(healthy control，HC)以及2型糖尿病患者攝食獎賞中樞影響的機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究共招募受試者17名，T2DM組9例，HC組8名。匹配兩組被試者年齡、性別和受教育程度。

T2DM組納入標準：(1)所有病例診斷均符合2010年美國T2DM協會診斷標準；(2)糖尿病病程中位數為6年，所有患者大于1年，小于10年；(3)服用藥物類型相同，不需要使用胰島素；(4)無嚴重并發癥；(5)右利手。

排除標準：(1)常規頭部MR掃描存在腦內灰白質異常信號；(2)合并腫瘤、其他內分泌疾病、高血壓或肝性腦病；(3)不能耐受磁共振者，(4)體內有金屬植入無法取出者；(5)神經心理學測試交流困難；(6)聽力障礙。

一般臨床資料包括：性別、年齡、受教育程度、體重指數(body mass index，BMI)、糖化血紅蛋白水平(HbA1c)、空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)及餐后血糖(postprandial blood glucose，PBG)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)、甘油三脂(triglyceride)、總膽固醇(total cholesterol)。利用胰島素抵抗指數(homeostasis model assessment 2-IR，HOMA2-IR)計算胰島素抵抗水平。HOMA2-IR Caculator由(https://www.rdm.ox.ac.uk/)提供。

本研究已通過中南大學湘雅三醫院醫學倫理委員會批準，每名受試者均被告知所有研究內容并要求簽署知情同意書。

1.2 MRI圖像采集

采用Philips 3.0 T磁共振掃描儀，8通道頭部線圈。受試者囑禁食12 h，提前3～4 d停藥，實驗前打好留置針以便多次采血。為了排除口服時腸蠕動及消化作用影響，每名受試者在不同日(間隔至少1周)用相同序列采集口服300 ml水后MR數據。為排除不同日掃描基礎狀態不同帶來的影響，先空腹掃描常規T1WI、T2WI、FLAIR水抑制序列、DWI序列及BOLD序列獲得基線值。口服亮氨酸后(食品級，上海sigma公司；亮氨酸用量：100 mg/(kg?d)，配300ml純凈水溶液(約2%濃度，人均約6.6 g))，根據亮氨酸代謝規律[12]以及為了排除苦味影響，受試者靜臥30 min之后開始掃描，連續動態掃描4個BOLD (每個BOLD序列約6 min 40 s)，時長約30 min。

本實驗所有研究對象由同一名高年資技師完成掃描，掃描過程中囑受試者放松、閉眼靜臥并保持頭部不動，保持清醒狀態。

掃描序列：(1)常規序列掃描T1WI、T2WI、FLAIR水抑制序列、DWI序列。(2) 3D T1結構像，參數：TR 2300 ms，TE 2.93 ms，TI 1100 ms，層厚 1 mm，視野(FOV) 240 mm×240 mm，體素大小1 mm×1 mm×1 mm，反轉角90°，矩陣240×240，共計226層矢狀面圖像，掃描時間為376 s。(3)靜息態腦功能成像掃描，采用回波平面成像(echo planar imaging sequence，EPI)序列，參數：TR 2000 ms，TE 30 ms，矩陣 64×64，FOV 240 mm×240 mm，層厚4 mm，間隔0 mm，得到200個全腦EPI數據。

1.3 血生化指標檢測

掃描前空腹采血，口服亮氨酸后每隔1個BOLD序列的時間采集一次血樣，掃描開始后，利用兩個BOLD序列之間的間隔時間采集一次血樣，每次采血3 ml，離心分離血清，離心參數2800轉/min，22攝氏度，離心6 min，-20度冰凍，每周送檢，血清送檢血糖及血胰島素，血漿送檢亮氨酸。質譜法分析血漿亮氨酸濃度、己糖激酶反應法測量血糖、用化學發光酶免疫分析法測量血胰島素。

1.4 統計分析

采用SPSS 22.0軟件統計17名受試者的各項臨床指標，先進行兩樣本Levene方差檢驗，之后進行兩獨立樣本t檢驗；性別進行χ2方檢驗，由于總樣本量n＜40，采用Fisher確切概率法檢驗。采用Pearson相關性分析法分析有意義腦區功能連接平均值與各臨床指標之間的相關性。

1.5 MRI數據處理

利用DPARSF (http://restfmri.net)軟件對轉換數據預處理：(1)為防止初始掃描受試者適應掃描過程會對結果造成影響，剔除前10個全腦EPI數據；然后對余下190個全腦EPI數據進行圖像層、運動校正；(2)把數據利用仿射變換轉換到標準MNI空間(montreal neurological institute，MNI)，體素大小設定為3 mm×3 mm×3 mm、用數據濾波去除噪聲干擾(范圍設定在0.01～0.10 Hz)；(4)基于Friston 24參數模型剔除頭動的影響。

選取大腦中攝食獎賞各相關腦區為種子點：根據初步分析本文選取雙側殼核和眶額皮層(orbitofrontal cortex，OFC)為種子點，分別計算它們與大腦其他體素間的功能連接，獲得功能連接圖像，采用Fisher轉換把計算得到的功能連接值轉換為z值。

采用單向AVONA分析分別對兩組被試者雙側殼核與全腦體素間功能連接進行組內比較，并采用AlphaSIM進行多重比較校正。顯著性結果用xjview軟件(http://www.alivelearn.net/xjview8/)呈現。提取正常被試組存在顯著統計差異團塊平均功能連接強度與相關臨床指標(HOMA2-IR，糖化血紅蛋白，空腹態血糖和血胰島素，給藥后第一個BOLD相應亮氨酸、血糖和血胰島素水平)進行Pearson雙因素相關性分析，同時提取T2DM相應團塊功能連接強度平均值進行相同統計分析。

2 結果

2.1 一般臨床資料

兩組受試者年齡、性別、受教育程度、BMI、CHOL、LDL均沒有顯著差異(P＞0.05)。FBG、PGB、HbAlc、TG、HDL在統計學意義上有顯著差異(P＜0.05；表1)。

表1 受試者基本信息和血生化指標Tab. 1 Demographic information and blood biochemical indicators of two groups

表2 正常組以殼核、OFC為種子點時有顯著功能連接改變腦區的MNI坐標Tab. 2 The MNI coordinates of brain regions with significant altered functional connection when choose putamen and OFC as seeds in HC groups

圖1 受試者口服亮氨酸后血漿亮氨酸、血胰島素及血糖變化趨勢圖。口服亮氨酸后，血胰島素(A)及血亮氨酸(B)顯著增加(P＜0.05)，血糖(C)未見顯著改變(P＞0.05)Fig. 1 The value change tendency of plasma leucine, plasma insulin and plasma glucose in two groups after oral leucine test. After oral leucine, the plasma insulin (A) and plasma leucine (B) increased significantly (P＜0.05), the plasma glucose (C) slightly lower than the baseline, but with no statistical significance (P＞0.05).

圖2 正常人與T2DM患者具有顯著差異的腦區分布圖。Limbic lobe：邊緣葉；Right Cerebellum：右側小腦；Cerebellar Tonsil：小腦扁桃體；ACC：前扣帶回；PFC：前額葉皮層；OFC：眶額皮層Fig. 2 The distribution of brain regions with significant differences between HC and T2DM patients.Note: ACC: anterior cingulate cortex. PFC: prefrontal cortex. OFC: orbitofrontal cortex.

2.2 血液生化指標

口服亮氨酸后T2DM組與正常對照組血漿胰島素與亮氨酸均明顯增高(P＜0.05)，血胰島素約27 min達峰值水平，T2DM組血胰島素基礎值高于正常對照組，口服亮氨酸后0～35 min兩組胰島素升高幅度無明顯差別，42 min兩組血胰島素量開始回落，正常對照組回落速度明顯大于T2DM組(P＜0.05)。血亮氨酸約35 min左右達峰值水平(圖1)，血糖水平未見顯著改變(P＞0.05)。

2.3 以殼核和眶額葉皮層為種子點的功能連接分析結果

根據初步分析本研究腦功能連接強度僅于正常組給藥后的第1個BOLD序列有顯著增加(P＜0.05)，因此本研究選取給藥后第1個BOLD序列功能連接值進行分析，此處對應著血亮氨酸峰值水平，結果顯示：正常人口服亮氨酸后右側小腦(小腦后葉、小腦扁桃體)與左側眶額皮層功能連接強度增加(P＜0.05)；雙側前額葉皮層(眶額皮層和前扣帶回、部分邊緣葉)與左側殼核功能連接強度增加(P＜0.05)，T2DM患者口服亮氨酸后上述腦區功能連接強度未見顯著改變(P＞0.05；圖2，表2)。

圖3 各項指標與部分有顯著差異腦區相關性分析圖。左側OFC為種子點時功能連接增加的腦區與空腹狀態胰島素水平(A)和HOMA2-IR之間的相關性(B)；左側OFC (C)及左側殼核(D)為種子點時功能連接增加的腦區與血亮氨酸之間的相關性Fig. 3 The graph of correlation analysis between various clinical indicators and some brain regions with significant differences.Correlation between functional connection increased brain regions with baseline HOMA2-IR (B) and insulin (A) when choose the OFC as seeds (A). Correlation between functional connection increased brain regions with plasma leucine when choose the left putamen (D) and the left OFC (C) as seeds (B).

2.4 大腦功能連接結果與相關臨床指標之間的相關性分析

結果顯示正常組的左側殼核和雙側前額葉(OFC、ACC)、邊緣葉之間的連接強度與相應時段亮氨酸水平呈正相關(r=0.749，P=0.032)，左側OFC和右側小腦后葉之間的功能連接強度與相應時段血亮氨酸水平呈正相關性(r=0.716，P=0.046)。糖尿病組亮氨酸水平與各腦區之間沒有相關性(P＞0.05)，其左側OFC與右側小腦功能連接強度與空腹胰島素水平呈負相關(r=-0.729，P=0.026)，但是與口服亮氨酸后胰島素水平無顯著相關性(P＞0.05)；左側OFC與右側小腦功能連接強度與HOMA2-IR呈負相關(r=-0.680，P=0.044；圖3)。

3 討論

3.1 關于大腦功能連接結果

在大腦中，攝食行為主要與獎賞系統及攝食中樞相關，包括下丘腦、杏仁核、伏隔核、腹側被蓋區、紋狀體、ACC、OFC、PFC、腦島等[13]。OFC是獎勵信息的“交通樞紐”[14-16]。殼核參與獎勵信號和獎勵預測[17]。OFC和小腦扁桃體能感受特定營養素[18]；PFC激活時會增加多巴胺神經元的激活，是獎賞攝食中樞重要核團[14-16，19]。ACC參與監測獎勵，與前額葉皮層和運動區域相互關聯[16]。邊緣系統與過度食物獎勵有關[14-16，19]。

本研究結果顯示，口服亮氨酸后正常組右側小腦后葉與左側OFC間的功能連接強度增加；雙側前額葉皮層(ACC、OFC、部分邊緣葉)與左側殼核連接強度增加，并且與血亮氨酸呈正相關。但同等條件刺激下，T2DM患者上述腦區功能連接無顯著增加，其功能連接平均值與血漿亮氨酸之間無顯著相關性，其左側OFC與右側小腦后葉功能連接強度與HOMA-IR、空腹狀態胰島素水平呈負相關。結果表明，亮氨酸可以刺激獎賞攝食相關腦區功能連接增加，這與既往研究報道的亮氨酸可以調節攝食一致。然而T2DM患者相應腦區不響應血亮氨酸濃度增高，并且隨著其胰島素抵抗程度增高伴隨這些腦區功能連接強度減弱，提示T2DM患者這部分腦區功能連接受損。

本研究結果與既往陳娟等[20]的OFC被證實在T2DM患者中與多個腦區連接存在異常的研究結果一致；Chris等[21]的研究也表明T2DM的ACC、PFC、小腦、邊緣皮質及殼核的灰質體積減少，Kulve等[11]表明T2DM可引獎賞攝食異常興奮，證實了T2DM這部分腦區相比正常人確實存在異常。另外，?st等[22]發現T2DM患者的中樞胰島素信號通路中mTORC1的反饋調節作用受損，mTORC1的功能受損、活化異常，從而引起胰島素抵抗，出現飽腹感下降致攝食成癮[22-24]。而亮氨酸又是mTOR的關鍵興奮因子[3，8]，大腦中亮氨酸主要是通過mTOR信號傳導抑制食物攝入[8-9，25-26]。T2DM患者亮氨酸感受器mTOR受損、胰島素信號通路傳導障礙以及大腦獎賞網絡結構功能受損，這可能是T2DM患者亮氨酸刺激后磁共振功能連接強度減弱、亮氨酸傳感無應答的機理。

3.2 關于血液生化指標結果

本研究結果發現隨著血亮氨酸濃度的升高，血胰島素明顯增高，血糖改變不顯著，這與既往研究一致[27]，但相關性結果表明腦功能連接強度與給藥后胰島素水平沒有相關性，Heni等[28]也表明胰島素不會影響食物攝入及相關腦區，Steinert等[29]表明口服給藥時僅有高濃度的血亮氨酸可以引起攝食抑制，血亮氨酸濃度需達到一定“閾值”，本研究其他BOLD序列大腦沒有響應或是與相應時段血亮氨酸濃度下降相關。因此，亮氨酸對獎賞攝食中樞的作用可能是獨立于胰島素以外的影響因素。

3.3 結論

總之，本研究利用fMRI研究了正常人以及T2DM患者在給予亮氨酸刺激下獎賞攝食相關腦區間的功能連接改變情況，亮氨酸可使正常人部分獎賞攝食腦區間功能連接增加，而T2DM相關腦區間功能連接無顯著增加，證明了T2DM患者左側殼核及左側OFC與多個腦區功能連接存在異常，其中以左側OFC與右側小腦后葉之間的連接強度與胰島素抵抗程度相關。口服亮氨酸后的rs-fMRI可以反映獎賞攝食相關腦區的功能連接強度的情況，中樞胰島素抵抗可能損傷大腦對亮氨酸的感知通路。

3.4 本研究的局限性

因為研究的設計復雜，招募困難，樣本含量較少，可能對本研究結果造成干擾；需要進一步排除治療方案對本研究的影響。