棘孢青霉右旋糖酐酶基因克隆及其在畢赤酵母中的表達

吳 敏，張宇馨，胡雪芹，張洪斌*

（合肥工業大學生物與醫學工程學院，安徽 合肥 230009）

右旋糖酐酶是一種能專一性斷裂右旋糖酐α-1,6糖苷鍵的水解酶，主要催化產物包括低聚右旋糖酐以及低聚異麥芽糖等。低聚右旋糖酐T70、T40、T20是重要的血漿代用品，具有補充血容量、改善微循環等作用[1]。低聚異麥芽糖是一種功能性低聚糖，具有調節腸道菌群、改善人體內微生態環境的作用[2-3]。除此之外，右旋糖酐酶及其衍生物還可用于糖蜜制作和飲料加工[4]、防治齲齒、保持口腔衛生[5-6]等，具有重要的應用價值。目前關于右旋糖酐酶的研究主要集中在產生菌株的挖掘以及酶學性質的研究，但野生菌株遺傳背景不清晰、代謝復雜等缺陷[7]，極大程度限制了右旋糖酐酶在工業生產中的應用。為解決這一問題，國內外學者開始在工程菌中對右旋糖酐酶基因進行克隆表達，其中畢赤酵母以其綠色安全、表達量高的優勢受到廣泛關注。1996年Roca等[8]首次在畢赤酵母菌株中表達了朱黃青霉右旋糖酐酶（Penicillium minioluteum IMI068219），甲醇誘導106 h后右旋糖酐酶產量達到3.2 g/L，酶活力為65.3 U/mg。梁達奉[9]分別構建了誘導型、組成型2 種不同的重組酵母菌分泌表達朱黃青霉右旋糖酐酶（Penicillium minioluteum HI-4），搖瓶酶活力分別為75、60.4 U/mL。黃曾慰等[10]通過密碼子優化進一步提高朱黃青霉右旋糖酐酶（Penicillium minioluteum HI-4）在畢赤酵母中異源表達產量。青霉菌是右旋糖酐酶的主要來源菌屬，包括繩狀青霉[11]、點青霉[12-13]、嗜松青霉[14]、朱黃青霉、棘孢青霉[15-16]等。但目前關于青霉菌屬右旋糖酐酶的克隆表達主要集中于朱黃青霉，其他青霉屬右旋糖酐酶的相關研究鮮有報道，棘孢青霉F1001[16]是本實驗室篩選獲得的高產右旋糖酐酶菌株，具有較高的產酶能力，所分泌表達的右旋糖酐酶是內切型右旋糖酐酶并具有優良的酶學性質，對其進行進一步的克隆表達分析有利于加強對青霉屬右旋糖酐酶的認識，也有利于提高右旋糖酐酶的工業應用潛力。

本實驗合成了棘孢青霉F1001右旋糖酐酶基因（GenBank登錄號KF999646.1）并對序列進行優化，分別將優化前后的右旋糖酐酶基因序列克隆至畢赤酵母中進行異源表達，特異性篩選獲得陽性菌株。對重組酶的酶學性質進行考察并對搖瓶發酵條件進行優化探索。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棘孢青霉H5、大腸桿菌DH5α為本實驗室保存；畢赤酵母X33、質粒pPICZαA 美國Invitrogen公司；限制性內切酶、連接酶、聚合酶 北京全式金生物有限公司；Trizol提取試劑盒、第1鏈cDNA合成試劑盒、博來霉素 生工生物工程上海（股份）有限公司。

1.2 培養基

LLB培養基：胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 5 g/L，pH 7.0。棘孢青霉誘導培養基：右旋糖酐T70 15 g/L、蛋白胨5 g/L、K2PO4·3H2O 1 g/L、FeSO4·7 H2O 0.01 g/L、KCl 0.5 g/L、MgSO4·7 H2O 0.5 g/L，pH 5.5。BMGY培養基：酵母浸出物10 g/L、蛋白胨20 g/L、100 mmol/L磷酸鈉（pH 5.0）、無氨基酵母氮源YNB 13.4 g/L、生物素0.4 mg/L、甘油10 g/L。BMMY培養基：酵母浸出物10 g/L、蛋白胨20 g/L、100 mmol/L磷酸鈉（pH 5.0）、YNB 13.4 g/L、生物素0.4 mg/L、體積分數1%甲醇。

藍色右旋糖酐T-2000平板：藍色右旋糖酐20 g/L、YNB 13.4 g/L、生物素0.4 mg/L，在倒置的皿蓋上加入1%（相對于固體培養基體積）甲醇。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養

棘孢青霉培養：PDA平板連續活化棘孢青霉菌株，單菌落接種至棘孢青霉誘導培養基中（50 mL/250 mL錐形瓶），30 ℃，250 r/min培養5 d。

大腸桿菌培養：將大腸桿菌接入50 mL LLB培養基中于37 ℃、220 r/min培養24 h。

畢赤酵母培養：將重組菌單菌落接入30 mL YPD培養基中，30 ℃、250 r/min培養過夜至OD600nm值為5，然后以體積分數1%接種量轉接至50 mL BMGY培養基中去葡萄糖抑制，30 ℃、250 r/min培養至OD600nm值為4～6時，離心，BMMY重懸菌體，25 ℃、250 r/min培養，每24 h添加甲醇至終體積分數1%誘導產酶。

1.3.2 酶活力和總蛋白的測定

右旋糖酐酶活力測定采用還原糖測定方法——DNS法[17]：發酵液于4 ℃、8 000 r/min離心5 min，棄沉淀，上清液稀釋一定倍數。將4 mL 0.02 mol/L pH 5.0的醋酸鹽緩沖液配制的3%右旋糖酐T70溶液置于35 ℃保溫10 min后加入1 mL稀釋的酶液，保溫1 h后，取樣500 μL，與375 μL DNS混合，沸水浴5 min，冷卻至室溫定容至終體積5.375 mL。滅活的酶液作為對照組，每分鐘產生1 μmol還原糖所需的酶量定義為一個酶活力單位（U）。

總蛋白測定：利用Bradford法[18]測定蛋白含量，以牛血清蛋白為標準繪制蛋白標準曲線。將1 mL發酵液與4 mL考馬斯亮藍G250在常溫下反應10 min后，在595 nm波長下測定吸光度，計算蛋白含量。

1.3.3 dex基因合成

活化培養棘孢青霉菌，離心收集菌體，無菌水洗滌，液氮研磨，試劑盒提取總RNA，反轉錄合成第1鏈DNA，根據NCBI數據庫中已知的右旋糖酐酶基因序列進行分析，以朱黃青霉HI-4（GenBank號L41562.1）編碼序列為模板，設計特異性上游引物F、下游引物R（表1），以第1鏈DNA為模板進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）特異性擴增，得到雙鏈DNA片段，即dex基因序列，通過T克隆與pMD18-T載體連接，熱擊轉入E. coli DH5α中，藍白斑篩選獲得陽性克隆子，測序獲得棘孢青霉右旋糖酐酶基因序列，并將序列提交至GenBank。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.3.4 右旋糖酐酶密碼子優化

利用軟件Gene Designer對棘孢青霉右旋糖酐酶基因dex進行密碼子優化，通過同義密碼子替換的方式調整目的基因GC相對含量以及密碼子偏好指數，序列文件送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行全基因合成。

1.3.5 重組表達質粒構建

根據右旋糖酐酶序列文件設計合成引物（表1），分別在上下游引物中添加EcoRI以及NotI位點（下劃線表示），并在上游引物中引入Kozark序列（加粗部分）。PCR分別擴增dex、opt-dex序列后通過雙酶切的方式與載體pPICZαA連接，42 ℃熱擊將連接產物轉入E. coli DH5α中，在含有博來霉素抗性的LLB平板上篩選重組質粒，PCR以及雙酶切鑒定陽性克隆并測序。

1.3.6 重組畢赤酵母構建及表達

SacI線性化重組質粒后轉入畢赤酵母X33中，通過高質量濃度博來霉素（100、200、300、400、500 μg/mL）連續篩選，然后將篩選獲得的單克隆點種在藍色右旋糖酐T-2000平板進行特異性篩選，陽性菌落能夠分泌產生右旋糖酐酶水解藍色右旋糖酐T-2000，在單菌落周圍形成透明圈。選取能產生水解圈的單克隆進行搖瓶表達，并根據1.3.2節測定誘導發酵96 h的重組酶活力，篩選產酶能力高的重組酵母菌株。

1.3.7 重組右旋糖酐酶分離純化

將500 mL發酵粗酶液與500 mL冰預冷丙酮混合，4 ℃靜置10 min，8 000 r/min離心15 min棄上清液，用冰預冷丙酮洗滌3 次后，取10 mL 0.02 mol/L pH 5.0醋酸鹽緩沖液溶解沉淀，粗酶液濃縮50 倍。將10 mL濃縮液與磁珠混合，在磁場作用下實現目標蛋白與鎳離子的結合、雜蛋白洗脫以及目標蛋白的分離，獲得較高純度的重組右旋糖酐酶，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢驗純化效果。

1.3.8 重組右旋糖酐酶酶學性質測定

在15～70 ℃分別測定重組右旋糖酐酶活力，考察重組酶的最適反應溫度，并在梯度溫度下保溫1 h考察重組酶熱穩定性，以酶活力最高為100%，計算相對酶活力；配制pH 2～9的緩沖液，測定不同pH值環境中重組右旋糖酐酶活力，考察重組酶最適反應pH值，并在梯度pH值條件下孵育1 h后考察重組酶的pH值耐受性，以酶活力最高為100%，計算相對酶活力。

選擇含有不同鍵型的多糖，測定不同底物催化條件下的重組酶活力，考察重組右旋糖酐酶的底物特異性。然后選擇重組右旋糖酐酶的最適反應底物，配制成不同濃度的底物溶液，測定重組右旋糖酐酶反應初速率，計算得到重組酶的米氏常數Km值和最大反應速率vmax。

1.3.9 搖瓶優化單因素試驗

為進一步提高畢赤酵母分泌表達外源蛋白能力，對畢赤酵母搖瓶發酵條件進行優化，基本培養條件同1.3.1節。考察每24 h添加甲醇至終體積分數為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3.0%時重組酵母產酶能力；考察搖瓶裝液量為25、50、100、150、200 mL/500 mL時重組酵母產酶能力；考察培養基pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0時重組菌產酶能力；考察誘導溫度為20、25、30 ℃時重組酵母菌產酶能力；接著優化非離子表面活性劑吐溫-80、吐溫-20及其不同添加量對重組酵母產酶影響；優化碳源種類山梨醇、甘油及其添加量對重組菌產酶能力的影響。實驗均做3 個平行，標準差在圖中以誤差線標示。

2 結果與分析

2.1 dex基因合成結果

提取棘孢青霉總RNA，如圖1A所示，獲得28S、18S的rRNA條帶，無明顯拖尾現象，說明總RNA質量良好。再以總RNA中的mRNA為模板反轉錄合成cDNA，PCR擴增得到右旋糖酐酶基因dex，如圖1B所示，基因長度為1 866 bp。

圖1 棘孢青霉右旋糖酐酶基因電泳圖Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of the Penicillium aculeatum gene encoding dextranase

2.2 基因密碼子優化

表2 棘孢青霉右旋糖酐酶基因優化前后密碼子使用頻率Table 2 Codon usage frequency of dex and opt-dex in Pichia pastoris

通過同義突變，將在畢赤酵母中利用的低頻密碼子替換成高頻密碼子，右旋糖酐酶基因序列優化前后密碼子分布如表2所示，例如編碼Ala的GCG密碼子在畢赤酵母中使用頻率極低，僅6.1%，因此優化后的右旋糖酐酶序列中不再使用GCG編碼Ala，采用酵母偏好性較高的GCT進行編碼。再綜合考慮基因序列的GC相對含量、酶切位點、不穩定序列等因素，優化后的基因序列的密碼子偏好指數從原始序列的0.65調整至0.92（密碼子偏好指數在0.8～1.0之間更有利于外源蛋白的表達），序列GC相對含量從49.4%降至38.3%，去除了原始序列中的TAAAT不穩定序列。

2.3 重組畢赤酵母構建及表達結果

分別將dex與opt-dex基因與表達質粒載體pPICZαA連接，SacI線性化后電擊轉化至畢赤酵母X33基因組中，藍色右旋糖酐平板篩選結果如圖2所示，圖2A、2B分別表示密碼優化后opt-dex以及密碼子優化前dex序列在畢赤酵母中的表達情況。并且圖2A顯示甲醇誘導24 h后的情況，圖2B表示甲醇誘導72 h后才出現微弱的水解圈，可以初步判斷密碼子opt-dex序列在畢赤酵母中具有更高的右旋糖酐酶表達能力。

進一步選擇圖2A中水解圈較明顯的A1、A3、A5、A6、A7、A10以及圖2B中唯一的陽性菌落B13進行搖瓶表達，結果如圖3所示，B13的表達能力明顯低于A組菌株。其中A組中A5具有較高產酶活力，在搖瓶的表達酶活力達到89.56 U/mL，選擇該菌株進行后續研究。

圖2 陽性克隆子篩選Fig. 2 Selection of positive transformants

圖3 轉化子的搖瓶發酵篩選Fig. 3 Selection of transformants producing dextranase by shake flask fermentation

2.4 重組右旋糖酐酶分離純化結果

發酵粗酶液經濃縮后如圖4A所示，樣品中含有大量的雜蛋白條帶以及其他雜質成分，以至于對其他泳道造成了嚴重的擠壓。磁珠純化后的重組右旋糖酐酶如圖4B所示，目標條帶單一，說明純化后的酶液具有較高純度。SDS-PAGE同時也表明重組右旋糖酐酶大小為65 kDa，與理論蛋白大小符合。

圖4 重組右旋糖酐酶純化結果Fig. 4 SDS-PAGE analysis of purified recombinant dextranase

2.5 重組右旋糖酐酶酶學性質分析

2.5.1 重組右旋糖酐酶最適催化條件及穩定性

如圖5A所示，重組右旋糖酐酶最適催化溫度為35 ℃，隨著溫度升高酶活力逐漸降低，但在70 ℃的高溫條件下進行催化反應仍然能夠表現出40%的剩余酶活力。與天然棘孢青霉右旋糖酐酶相比較[16]，具有相同的最適催化溫度，以及相似的對高溫和低溫的酶活力響應趨勢。但是在溫度穩定性實驗中，天然酶在45 ℃中保存1 h仍然保留95.67%的酶活力，而重組酶在45 ℃保溫1 h剩余酶活力僅為75%，并且在50 ℃保溫1 h后重組右旋糖酐酶剩余酶活力降低至46%，而天然酶剩余活力在80%以上[16]。說明經過酵母表達的重組右旋糖酐酶在溫度穩定性上與天然酶相比有一定程度的降低。

對重組右旋糖酐酶的最適催化pH值考察，結果如圖5B所示，發現其最適催化pH值為5.0，當pH值大于5.0時，酶活力迅速降低，當pH值升高到9.0時，重組右旋糖酐酶幾乎全部失活。重組右旋糖酐酶在pH 4.0～7.0緩沖液中孵育1 h后能夠保留80%以上的酶活力。重組酶的最適催化pH值以及在不同pH值條件下的穩定性與天然棘孢青霉右旋糖酐酶一致[16]。

圖5 重組右旋糖酐酶酶學性質Fig. 5 Enzymatic properties of the recombinant dextranase

2.5.2 重組右旋糖酐酶底物特異性

由表3可知，將重組右旋糖酐酶作用于不同的糖類底物，發現了與天然右旋糖酐酶相同的底物特異性，即專一性作用于α-1,6糖苷鍵，不作用于β-1,4、β-1,2以及α-1,2等其他糖苷鍵型。以右旋糖酐T70為底物，配制0.1%～1.0%的底物溶液，計算得到重組右旋糖酐酶的Km為87.56 μmol/L，vmax為428.02 μmol/（min·mg）。

2.6 搖瓶水平重組酵母發酵條件優化結果

發酵培養環境對酵母分泌表達能力具有很大的影響[19]，因此可以嘗試通過改善酵母的發酵條件提高酵母分泌表達外源蛋白的能力。首先對重組酵母發酵培養基發酵pH值、誘導劑添加量、表面活性劑含量、碳源添加量、裝液量等參數進行單因素優化。結果表明單因素優化后的培養條件使重組酶活力提高了2.6 倍，從初始的89.56 U/mL提高到了240.74 U/mL，總蛋白質量濃度為0.068 mg/mL。

在重組畢赤酵母中甲醇誘導AOX1啟動子表達重組右旋糖酐酶，如圖6A所示，當甲醇添加量為1.0%（每24 h）時重組酶活力達到122 U/mL。高于1.0%（每24 h）時，隨著甲醇添加量的增加，酶活力逐漸降低。通過搖瓶中的裝液量控制通氣量，實驗結果如圖6B所示，500 mL錐形瓶中裝液量為25 mL、50 mL時產酶量相當，以50 mL時為最佳。發酵pH值優化結果如圖6C所示，當pH 5.0時酶活力最高，酸性堿性環境下產酶量急劇降低。低溫發酵能夠降低中性蛋白酶對目標外源蛋白的降解，促進新生肽的折疊，提高目標蛋白的穩定性，以及減輕發酵過程的氧氣壓力[20-21]。在20、25、30 ℃三個溫度梯度下考察右旋糖酐酶活力，如圖6D所示，25 ℃時重組右旋糖酐酶活力為30 ℃時的1.6 倍。20 ℃發酵120 h酶活力與25 ℃發酵96 h酶活力相當，以25 ℃為最佳發酵溫度。非離子表面活性劑具有增加細胞壁滲透的作用，從而提高重組酵母的分泌能力[22]。考察吐溫-80、吐溫-20兩種常見的表面活性劑對酵母分泌的影響，如圖6E所示，當吐溫-80添加量為4 g/L時，發酵上清液的右旋糖酐酶活力增加到230.74 U/mL。在甲醇發酵誘導階段，甲醇既作為碳源維持酵母生長，又作為誘導劑誘導外源蛋白的合成[23]。在酵母發酵過程中以山梨醇或者甘油為協同底物提供酵母生長所需碳源，以減輕酵母代謝壓力[24-25]。如圖6F所示，以山梨醇作為碳源的效果明顯優于甘油，當山梨醇添加量為5 g/L時，重組右旋糖酐酶活力達到240.74 U/mL。

圖6 重組畢赤酵母發酵產酶水平的初步搖瓶優化Fig. 6 Optimization of shake flask culture of the recombinant P. pastoris for dextranase production

3 討 論

目前已報道的右旋糖酐酶編碼基因主要來源于青霉菌屬、桿狀菌屬以及鏈球菌屬等，除朱黃青霉外其他青霉來源的右旋糖酐酶基因鮮有報道。因此通過對棘孢青霉來源的右旋糖酐酶的研究可以加深對青霉屬右旋糖酐酶的認識。朱黃青霉右旋糖酐酶的最適催化溫度為55 ℃，高于天然棘孢青霉酶右旋糖酐酶的35 ℃，但其熱穩定性差，在50 ℃條件下保溫15 min酶活力損失50%以上[9]，而棘孢青霉右旋糖酐酶在50 ℃保溫1 h后仍然能保留80%以上的酶活力，并且在最適溫度35 ℃條件下保溫2 d后仍然能保留88%的酶活力[16]。細麗毛殼菌來源的右旋糖酐酶目前已經小規模產業化，該酶最適催化溫度為60 ℃、pH 5.5，專一性催化斷裂糖酐鏈中連續的α-1,6糖苷鍵，但該酶液同樣也存在溫度穩定性差的現象，65 ℃時半衰期為10 min，60 ℃時半衰期為250 min[26]，而棘孢青霉右旋糖酐酶的溫度穩定性表明在最適催化溫度條件下保藏24 h后，仍然能保留93.5%的酶活力，10 d后酶活力降至50%，說明與朱黃青霉右旋糖酐酶以及細麗毛殼菌右旋糖酐酶相比，棘孢青霉右旋糖酐酶雖然具有相對較低的最適催化溫度，但其具有更好的溫度穩定性，更加適應工業生產長時間的催化要求。

以棘孢青霉菌為模板，反轉錄合成右旋糖酐酶編碼基因，優化序列后在畢赤酵母中進行表達。畢赤酵母分泌表達的重組右旋糖酐酶最適催化溫度為35 ℃、最適催化pH值為5.0，具有與天然酶相似的催化性質。但在溫度穩定性上略有降低，類似的情況也出現在斯達克油脂酵母（Lipomyces starkeyi 1390）來源的右旋糖酐酶基因的異源表達中，異源表達的重組右旋糖酐酶最適溫度為30 ℃，低于天然酶的55 ℃，最適pH 4.5，低于天然酶的5.0[27-28]，可能是因為異源表達過程中不同的表達體系對蛋白結構進行了一定程度的修飾，具體原因有待進一步深入研究。

在搖瓶水平上對重組酵母的產酶能力進行單因素優化，優化后重組酶活力達到240.74 U/mL，高于Chen Lin等[27]在5 L發酵罐獲得83.9 U/mL的重組酶活力，Kang等[7]在10 L的發酵罐中獲得的134 U/mL的酶活力，低于梁達奉等[17]在5 L發酵罐中獲得的1 048 U/mL（誘導型）以及398 U/mL（組成型）重組酶活力，但高于其搖瓶單因素優化后的75 U/mL（誘導型）以及60.4 U/mL（組成型）。說明重組棘孢青霉右旋糖酐酶在搖瓶水平的表達能力達到國內現有水平。但是在搖瓶水平總蛋白質量濃度低，僅為0.068 mg/mL，顯著低于Roca等[8]在10 L發酵罐中表達的右旋糖酐酶產量。但畢赤酵母是一種適合高密度發酵的菌株，在發酵罐中畢赤酵母分泌表達能力能夠顯著提高，例如里氏木霉Cel5基因在5 L發酵罐中酶活力相比搖瓶提高了11 倍[29]、雪白根霉在50 L發酵罐中的酶活力相對于搖瓶發酵提高了40 倍[30]。所以可期望通過高密度發酵條件優化，進一步提高重組畢赤酵母分泌表達右旋糖酐酶的能力。

以棘孢青霉基因組為模板克隆得到右旋糖酐酶編碼基因，序列優化后整合到畢赤酵母X33中，表達后的右旋糖酐酶具有與天然酶相似的酶學性質，說明重組右旋糖酐酶可以代替天然棘孢青霉右旋糖酐酶直接應用于工業催化制備右旋糖酐。條件優化后重組畢赤酵母搖瓶產酶能力達到240.74 U/mL，達到國內現有搖瓶表達水平。